反转录酶的选择:
1. Money 鼠白血病病毒(MMLV)反转录酶:有强的聚合酶活性,RNA酶H活性相对较弱。最适作用温度为37℃。! Z T3 Z: v% Y$ P* ?
2. 禽成髓细胞瘤病毒(AMV)反转录酶:有强的聚合酶活性和RNA酶H活性。最适作用温度为42℃。) F# O8 W9 A% O
3. Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜热微生物的热稳定性反转录酶:在Mn2+存在下,允许高温反转录RNA,以消除RNA模板的二级结构。
4. MMLV反转录酶的RNase H-突变体:Invitrogen公司商品名为SuperScript 和SuperScriptⅡ。此种酶较其它酶能多将更大部分的RNA转换成cDNA,这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的mRNA模板合成较长cDNA。
扩增酶的选择:
1. 对于小于4kb的产物使用Taq DNA聚合酶或Platinum Taq DNA聚合酶。' o1 U3 |8 F* C$ B
2. 对于小于12kb的产物使用Platinum Pfx Taq DNA聚合酶或Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity。
3. 对于大于12kb的产物使用ELONGAE或Enzyme Mix。
4. 对于一步法RT-PCR,如果产物小于3.5kb,使用Taq DNA聚合酶或Platinum Taq DNA聚合酶;如果产物小于9kb,使用Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity。