一、原理
菌落总数:指在一定条件下(如需氧情况、营养条件、pH、培养温度和时间等)每克(每毫升)检样所生长出来的细菌菌落总数。按国家标准方法规定,即在需氧情况下,37℃培养48h,能在普通营养琼脂平板上生长的细菌菌落总数,所以厌氧或微需氧菌、有特殊营养要求的以及非嗜中温的细菌,由于现有条件不能满足其生理需求,故难以繁殖生长。因此菌落总数并不表示实际中的所有细菌总数,菌落总数并不能区分其中细菌的种类,所以有时被称为杂菌数,需氧菌数等。
大肠菌群:指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。该菌主要来源于人畜粪便,故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量,推断食品中有否污染肠道致病菌的可能。食品中大肠菌群数系以100ml(g)检样内大肠菌群最可能数(MPN)表示。
人沙门氏菌病有四类综合症:沙门氏菌病;伤寒;非伤寒型沙门氏菌败血症和无症状带菌者。沙门氏菌胃肠炎是由除伤寒沙门氏菌外任何一型沙门氏菌而所致,通常表现为轻度,持久性腹泻。伤寒实际上是由伤寒沙门氏菌所致。未接受过治疗的病人致死率可超过10%,而对经过适当医疗的病人其致死率低于1%,幸存者可变成慢性无症状沙门氏菌携带者。这些无症状携带者不显示发病症状仍能将微生物传染给其他人(传统的例子就是玛丽伤寒)。
沙门氏菌胃肠炎,潜伏期一般6-72小时,主要症状为恶心、呕吐、腹绞痛、腹泻、发热寒颤头痛。病程一般1-2天或更长。感染剂量为15-20个菌,死亡率达1-4%。最易感群体是年幼儿童、虚弱者、年长老人、免疫缺陷者等。污染源主要是人和家畜的粪便,沙门氏菌常存在于动物中,特别是禽类和猪。在许多环境中也有存在。从水,土壤,昆虫中,从工厂和厨房设施的表面和动物粪便中已发现该类细菌。它们可以存在于多类食品中,包括生肉,禽,奶制品和蛋,鱼,虾和田鸡腿,酵母,椰子,酱油和沙拉调料,蛋糕粉,奶油夹心甜点,顶端配料,干明胶,花生露,橙汁,可可和巧克力。
沙门氏菌属也是嗜温性细菌,在中等温度,中性pH,低盐和高水活度条件下生长最佳。生长最低水活度为0.94。兼性厌氧,对中等加热敏感。同样,该菌属能适应酸性环境。通过卫生以防止二次污染;蒸煮;巴氏消毒等控制。正常家庭烹调,个人卫生可以防止煮熟食品的二次污染,以及控制时间和温度一般都能充分防止沙门氏菌病的发生。
二、目的
1.了解大肠菌群作卫生指标原因及检测原理、菌种鉴定原理。
2.正确测定食品中细菌总数和大肠菌群数,会从EMB平板上区分大肠菌群。
3.了解食品中和食物中毒样品中沙门氏菌的检验
三、 仪器和材料
1. 溶液或试剂
2. 样品:水样、饮料等
3. 培养基:具体见附录1
4. 仪器或其它用具 灭菌三角烧瓶,灭菌培养皿,灭菌吸管,灭菌试管无菌三角玻棒、
记号笔,接种环、试管架、酒精灯、火柴、标签纸等。
四、 实验内容与方法
(一) 样品的采集和处理
1. 自来水水样
先冲洗水龙头,用酒精灯灼烧龙头,放水5-10min,在酒精灯旁打开水样瓶盖(或棉花塞),取所需的水量后盖上瓶盖(或棉塞),迅速送回实验室检验,若来不及检验放在4℃冰箱内保存,24h内检验。
经氯处理的水中含余氯,会减少水中细菌的数目,采样瓶在灭菌前加入硫代硫酸钠,以便取样时消除氯的作用。硫代硫酸钠的用量视采样瓶的大小而定。若是500mL的采样瓶,加入1.5%的硫代硫酸钠溶液1.5mL(可消除余氯量为2mg/L的450mL水样中全部氯量。
2. 河湖、井水、海水
用特制的采样瓶采集水样,若是测定好氧微生物,应立即改换无菌棉花塞。迅速送回实验室检验,若来不及检验放在4℃冰箱内保存,24h内检验,污水要在6h以内结束检验。
3. 蛋类
液全蛋(均状):无菌操作称25g置于无菌的500mL锥形烧瓶或其它合适容器中。加225mL胰胳胨(胰化物)大豆肉汤(TSB)并振荡充分混匀。在室温下静置60分钟,振摇使其充分混匀,用试纸测定pH值。必要时调节pH值至6.8±0.2,置35℃培养24±2小时。
4. 液奶(去脂牛奶,含2%脂肪牛奶,全脂奶,和脱脂奶)
无菌操作称取25g或者吸取25mL样品,放入灭菌带螺旋帽的广口瓶中(500mL)或其他合适的容器内。振摇使充分混匀,用试纸测定pH值。必要时用灭菌的1NNaOH或1NHcl调节pH至6.8±0.2。在测定最终pH前要盖紧瓶盖并充分混匀。
(二) 菌落总数的测定
检样→做成几个适当倍数的稀释度→选择2个~3个适宜稀释度各取1mL分别加入灭菌培养皿中→每皿内加入适量营养琼脂(36℃±1℃,48h±2h)→菌落计数→报告
(三) 多管发酵法测定大肠菌群
1. 初发酵试验
在3根含有10ml单倍的乳糖蛋白胨发酵试管中各加入样品0.1ml,在3根含有10ml单倍的乳糖蛋白胨发酵试管中各加入样品1ml,在3根含有10ml双倍浓缩(或者5ml三倍浓缩)的乳糖蛋白胨发酵试管中各加入样品10ml(如图所示)。混匀后,37℃培养24h,24h未产气的继续培养至48h。
2. EMB平板分离
经24h培养后,将产酸产气及48h产酸产气的发酵管,分别划线接种于伊红美兰琼脂平板上,再于37℃培养18~24h,将符合下列特征的菌落的一小部分,进行涂片,革兰氏染色,镜检。
1深紫黑色、有金属光泽。
2紫黑色,不带或略带金属光泽。
3淡紫红色、中心颜色较深。
3.复发酵试验
经过涂片、染色、镜检,如为革兰氏阴性无芽孢杆菌,则挑取该菌落的另一部分,重新接种于普通浓度的乳糖蛋白胨发酵管中,每管可接种来自同一初发酵管的同类型菌落1~3个,37℃培养24h,结果若产酸产气,即证实有大肠菌群的存在。
证实有大肠菌群存在后,再根据初发酵试验的阳性管数查表,即得大肠菌群数。
(四)沙门氏菌的检验
1.增菌试验
取样25g (m1),加入225ml缓冲蛋白胨水中,36+1℃培养4小时,移取10ml接种于100ml氯化镁孔雀绿增菌液内,于42℃培养18~24小时。
2.分离纯化
取增菌液1环,划线接种于一个DHL平板上,于36℃培养18~24小时,沙门氏菌Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、在DHL平板上菌落特征为无色半透明,产硫化氢菌落中心带黑色或几乎全黑色,沙门氏菌Ⅲ在DHL平板上菌落特征为乳糖迟缓阳性或影星的菌株与其它沙门氏菌相同,乳糖阳性的菌株为粉红色,中心带黑色。
3.生化试验
挑取选择性琼脂平板上的可疑菌落,接种于三糖铁琼脂中。在三糖铁琼脂中内,沙门氏菌的主要反应:斜面为红色,底部变黑并产气。
4.血清学试验(试验略)
5.菌型的判定和结果报告
综合以上生化试验和血清学分型鉴定的结果,按照有关沙门氏菌属抗原表(见GB/T 4789.4-2003第27页)判定菌型,并报告结果。
五、实验报告
(一)菌落计数及报告方法
用肉眼观察,计平板上的细菌菌落总数,也可用放大镜和菌落计数器计数。记下同一浓度的三个平板上的菌落总数,计算平均值,再乘以稀释倍数即1mL检样中细菌菌落总数。各种不同情况的计算方法如下:
1首先选择平均菌落数在30~300之间者进行计算,当只有一个稀释度的平均菌落符合此范围时,则以该平均菌落数乘以其稀释倍数报告之(表10-1例1)。
2若有两个稀释度的平均菌落落在30~300之间,则按两者之菌落总数之比值来决定,若其比值小于2应报告两者之平均数,若大于2则报告其中较小的菌落总数(表10-1例2及例3).
3若所用稀释度的平均菌落数均大于300,则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之(表10-1例4).
4若所有稀释度的平均菌落数均小于30,则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之(表10-1例5)。
5若所有稀释度的平均菌落数均不在30~300之间,则以最接近300或者30的平均菌落数乘以稀释倍数报告之(表10-1例6)。
6在求同稀释度的平均数时,若其中一个平板上有较大片状菌落生长时,则不宜采用,而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的平均菌落数。若片状菌落约为平板的一半,而另一半平板上的菌落数分布很均匀,则可按半平板上的菌落计数,然后乘以2作为整个平板的菌落数。
7菌落计数的报告,菌落数在100以内时按实有数报告,大于100时,采用二位有效数字,在二位有效数字后面的位数,以四舍五入方法计算。为了缩短梳子后面的零数,可用10的指数来表示。在报告菌落数位“无法计数”时,应注明样品的稀释倍数。