一、原核细胞表达载体
1. pBAD载体:
该载体中,表达质粒含有araBAD(arabinose)操纵子的PBAD启动子和编码该启动子的正负调控子基因araC,具有紧密调控功能和高水平表达外源蛋白质的原核细胞表达载体。
使用该载体实验时请注意:
1.当要扦入其他信号肽片段,改建此载体时,请不要利用该载体上的Nde1 EcoR1 BamH1 Kpn1和 Pst1位点,以免造成重组困难,因为前述内切酶在此载体上均有二个位点,最好使用只有一个酶切位点的Sac1和Hind111位点。同时记住,如在不含任何信号肽的PBAD表达质粒扦入信号肽,其非编码N-末端要包含核糖体结合位点(RBS)核苷酸序列。
2. 在使用含Omp A分泌信号肽的PBAD表达质粒时,请应用Omp A分泌信号肽上的Sac1以及载体Hind11酶切位点,这些在载体序列上都是单个酶切位点。
2.pCAl-n & pCAl-pelB载体
该原核细胞表达载体是来源于以T7 RNA聚合酶为基础的pET载体,含有T7/LacO启动子、编码钙调素结合多肽标鉴和凝血酶切点的核苷酸序列。因此,该表达载体在E.coli BL21(DE3)或BL21(DE3)pLysS宿主菌中能高水平表达外源蛋白质、且这种表达的外源蛋白质因带有钙调素结合多肽和凝血酶切点,故该蛋白产物易于纯化和产业化。
(a). Pcal-n
M K R R W K K N F I A V S A A N R F K K I S S S G A L L V P
CATATG AAG GGACGATGGAAAAAACAATTTCATAGCCGTCTCAGCAGCCAACCCGCTTTAAGAAAATCTCATCCTCCGGGGCACTTCTGGTTCC
Nde1
R G S P G I L D S M G R L E L K L R S A
GCGTGGATCCCCGGGAATTCTAGACTCCATGGGTCGACTCGAGCTCAAGCTTAGATCCGCC
BamH1 Sma1 EcoR1 Nco1 Sal1 Xho1 Sac1 Hnd111
(b). Pcal-PelB:
Nde1
actggagact catATG AAA TAC CTA TTG CCT ACG GCA GCC GCT GGA TTG TTA TTA CTC GCG GCC CAG GGC
M K Y L L P T A A A G L L L L A A Q P
Nco1 Msc1 BamH1 EcoR1 Sal1
GCC ATG GCC aaggatcctaagtaagtagaattctgagtaggtaagtcgacaatcgcgtctagagccc cgacgcgctggg
A M A * * * * * *
3. pPOW3.0 表达载体
该原核表达质粒含有噬菌体的重叠λPRPL热诱导启动子和编码热敏感抑制子的C1857基因,可使宿主细胞在合成蛋白前获得高密度的宿主细菌,进行高水平目的蛋白表达,并对蛋白合成提供紧密控制。PelB分泌信号肽能指引合成的外源蛋白通过胞浆膜进入胞质。
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