创伤性关节软骨缺损及骨关节炎引起的关节软骨损伤是临床常见疾患,其临床治疗是一个难题细胞生物学和生物材料技术的发展,使得应用组织工程成为了修复关节软骨缺损的新方法Marcacci等2{认为,应用组织工程可以修复4cm-以上的关节软'r}·缺损.}C'}11等f3应用胶原支架构建的组织工程软骨治疗了2g例膝关节大面积全层软骨缺损患者,2年后症状明显改善,复查关节镜发现优良率达93/C.然而,组织工程软骨移植时固定困难、愈合慢、移植物易脱落,组织工程软骨与宿主软骨之间的整合不良是阻碍组织工程软骨临床推广应用的瓶颈.我们以软骨细胞和聚乳酸聚轻基乙酸聚合物(PLGA)支架构建高质量的组织工程软骨,成骨细胞和磷酸三钙(TCP)支架构建组织工程骨,缝合成骨软骨复合体,修复关节软骨缺损,探讨自体组织工程骨软骨复合体修复关节软骨缺损的可行性,评价修复效果.
材料与方法
1.材料:小型猪(1个月龄,泰州小型猪培育基地),DMFM/F12培养基(美国(Gibco公司),胎牛血清(杭州四季清公司),胰蛋白酶(美国Gibe.公司),n型胶原酶(美国Gibe.公司),Percoll分离液(美国Sigma公司),多聚赖氨酸(美国Sigma公司),hr_c}无纺网支架(_L海易括公司),n型胶原单克隆抗体(美国Calhiocheir公司),1,9一二甲基亚甲蓝(美国Sigma公司),硫酸软骨素(美国Sigma公司).
2.实验分组:A组(实验组):组织工程骨软骨复合体组;B组(对照组):单纯工程软骨;C组(空白组):软骨缺损不作处理.1个月龄小型猪18头分别编号,随机分入各组.
3.猪关节软骨的分离与扩增:取A组及B组小型猪,无菌条件下分离膝关节软骨,用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤2次,剪成约1mm3大小,0.25%胰酶37℃消化30min后,弃上清加人0.2%且型胶原酶37°C消化4h,分别用150目和200目滤网过滤,滤液1000r/min离心5min,收集细胞.锥虫蓝拒染法细胞活性计数≥%%,原代细胞以5×1oVL接种于药cm2培养瓶内培养.每3d换液1次,待细胞9O%融合后,按1:3传代,至第2代末各用.
4.猪成骨细胞细胞的分离与扩增:取A组小型猪,无菌条件下分离膝关节干骺端松质骨,操作同软骨细胞分离培养
5支架处理:将PLGA支架剪成直径4mm×2mm大小,将TCP支架打磨成直径4mm×3mm大小,分别浸泡无菌10%多聚赖氨酸,环氧乙烷消毒后各用:
6.细胞的接种与培养:分别收获软骨细胞和成骨绅胞,调整密度至4×1o1VL,取z个支架,置于6孔培养板内,每个支架缓慢滴加旬Itl细胞悬液,将支架移人37°C,5%c02的培养箱静置4h,每孔加21nl培养液.1d后加足量培养液,隔日换液,培养2周.
7.骨软骨复合体的构建:将A组相同编号的组织工程软骨及组织程骨,以可吸收线筹合固定成复合体.
8.分组手术:每次实验各组取1头小型猪,以C、B、A为序,依次手术.以氯胺酮肌注,戊巴比妥钠静脉维持麻醉.常规消毒一侧膝关节,取膝关节前方正中切口切开皮肤皮下及筋膜,外翻髌骨,暴露股骨髁.以4mm环钻于股骨髁负重面做软骨缺损.c组关闭伤口.B组植人相应编号的组织I程软骨,用可吸收线固定于周围软骨,关闭伤口.A组以环钻加深缺损,嵌人相应编号的组织ェ程骨软骨复合体,关闭伤口.6个月后取材检测.
9.大体标本观察:取出各实验膝关节,肉眼观察缺损处修复情况,包括修复组织的形态、色泽、表面光滑度、组织弹性D纵行切卉标本,切面观察修复处组织的形态以及与周围组织的结合情况.
10.组织学观察:标本切片分别用苏木素-伊红(HE)染色,II型胶原免疫组织化学染色镜下观察.应用Im鸭c~p∞p抵6.o图像分析系统对II型胶原免疫组织化学染色切片行II型胶原染色面积半定量分析.
11.氨基糖胺聚糖(GAG)含量检测:取标本,冷冻干燥.用1,9二甲基亚甲蓝法测定GAG含量.标准品为硫酸软骨素.
12.统计学方法:数据以均数±标准差表示9应用S°Cs13,0统计软件分析,各组之间比较采用单囚素方差分析,各组之间两两比较采用g检验.
结果
1,大体标本观察:A组缺损修复组织呈软骨样,表面光滑平坦,有弹性,有光泽,剖面观与周围软骨整合良好:B组修复组织呈纤维组织,表面高低起伏,弹性及光泽欠佳,与周围组织整合欠佳.c组缺损仍明显,软骨损伤区不规则扩大.
2.HE染色组织学观察A组软骨细胞增殖最旺盛,排列紧密,分布均匀,细胞被大量细胞外基质包围,融合成片,可见软骨陷窝,和周围组织整合紧密;B组次之;C组软骨细胞增殖最差,分布散乱,细胞外基质较少,未见融合成片.
3.Ⅱ型胶原免疫组织化学染色观察:.各组有Ⅱ型胶原免疫组织化学阳性染色A组棕黄色面积最大,颜色最深分布均匀:B组次之;C组棕黄色面积最小,颜色最浅,分布不均匀_应用Image-proplus6.0图像分析系统对11型胶原染色面积进行半定量分析(表1)方差分析显示各组染色面积之间差异有统计学意义(P<0.05),进一步做各组之间两两比较y检验显示:A组>B组>C组.
4.GAG含量结果比较:各组标本GAG含量结果见表1,方差分析显示各组GAG含量之间差异有统计学意义(P<0.05),进一步做各组之间两两比较q检显示:A组>B组>C组.
