CXC趋化因子受体-4(CXCR4)是趋化因子基质细胞衍生因子一1(SDF-lcx)的特异受体.有研究表明,SDF-1cx/CXCR4轴可以促进细胞迁移「23],并且可以促进细胞存活,抑制细胞凋亡.本实验旨在构建持续高表达CXCR4的慢病毒载体及慢病毒颗粒包装鉴定,并探讨体外细胞迁移,试图通过慢病毒载体及SDF-1a/CXCR4轴使持续高表达的基因治疗和细胞治疗相结合.
材料与方法
1.材料:第3代4质粒慢病毒包装系统来源于南开大学.大肠杆菌DH5a感受态购买自Tiangen公司.Taq酶、T4DNA连接酶、限制性内切酶XbaT,EcoRT均购自TaKaRa公司.胶回收试剂盒购自Axygen公司.胎牛血清、DMEM、胰酶一乙二胺四乙酸(EDTA)、青霉素、链霉素均购自Gibc.公司,Transwell小室为Corning-Corstar3422(美国).
2.建立大鼠cDXA文库:取50gSDnistar大鼠大脑组织,立即放入液氮中,加Trizol100g/L,碾磨均匀,4℃12000g离心10min,吸上清,室温放置5min,按每1mlTrizol加0.2ml氯仿混匀,室温放置3min,4℃12000g离心15min,吸上清重复4℃I2000g离心15min,吸上清,按1mlTrizol加0.5ml异丙醇,冰浴15min,40C12000g离心10min弃上清,用70%乙醇漂洗2次,加乙醇4℃7500g离心10min,弃上清,室温干燥,适量焦磷酸二乙醋(DEPC)H,0溶解,一20℃保存.提取的RNA为模板,逆转录一聚合酶链反应(RT-PCR)获得大鼠cDNA文库,反应体系为:SxRT缓冲液8N.,l,10m,二dNTP2}1,OligoldT(20N,,m)2},1,模板10p,1,MMLV2p,1,DEPCHZ016p,1共40p,1,反应条件为:420C60min,950C5min.
3.PCR获得目的基因CXCR4:以SDWistar大鼠为模板通过PCR获得大鼠CXCR4基因,目的基因引物为:上游引物5'-GCTCTAGAGCATGGAAATATA-CACTTCGGAT-3';下游引物5'-GGAATTCC`I"1'AGC'1'G-GAGTGAAAACTTGAG-3';反应条件:DNA变性温度为:98℃30s;退火温度为63℃30s;延伸温度为72℃90s.反应体系为:ddHzO34.61a,1,10xTag缓冲液5闪,dNTP4闪,上游引物2闪,下游引物2闪,cDNA模板2},l,Taq酶0.5p,1,总量为50μ1.
4.构建pCDHl-CXCR4-EF1-copGFP慢病毒载体质粒:用回收试剂盒回收CXCR.4基因片段,CXCR4纯化后基因片段与pCDHl-MCS-EF1-copGFP用XbaI,EcoRI双酶切,T4DNA连接酶将CXCR4基因连人pCDHl-MCS-EFl-copGFP,作用16h.此连接载体质粒命名为pCDHl-CXCR4-EFl-copGFP.
5.pCDHl-CXCR4-EF1-copGFP慢病毒载体质粒鉴定:取5闪连接产物转化DHSa感受态细菌,恒温箱370C培养14h,取单菌落370C,180、扩增14h,提取质粒,采用XbaI,EcoRI双酶切鉴定,并测序鉴定.
6.HEK293T细胞和Hela细胞培养:2种细胞均在DMEM培养基中培养,培养基中加100U/ml青霉素,100.可L链霉素,10%胎牛血清(FBS),培养箱条件为370C,5%的COz.
7第3代4质粒系统慢病毒颗粒包装:将pRsv-Rev、pMDLG/pRRE、pVSV一G和pCDHl-CXCR4-EFl-copGFP4质粒按照1:4:1:1的比例,采用PEI转染法,PEI4倍体积,质粒1倍体积室温混匀,静置10min,转染293T细胞,8h后换液,60h收集上清,离心2500r,5min,吸上清,0.45p.m的滤网过滤到50ml离心管中,超速离心40C,32000r,90min,弃上清,加双无培养基4℃过夜重悬分装,放置于一80℃保存.
分别取0,1,2,4,8闪病毒感染Hela细胞(1x105个),各3个复孔24h后换液,继续37℃培养至48h,倒置相差显微镜观察荧光.
8慢病毒颗粒滴度测定:按照流式细胞仪(BDFACSCalibur)要求处理细胞,铺24孔板Hela细胞,每孔细胞1x105个,DMEM500},l,37℃细胞培养箱培养24h然后从80℃冰箱每种病毒取2管超离的病毒按n}}闪/4x,1/8X1/16闪感染.感染前24孔板换液,X00闪D'1IE}}I(含40m彭L的二乙胺基乙基右旋糖昔),37℃细胞培养箱培养48h,各组设对照组及3个复孔.慢病毒颗粒感染Hela细胞24h第3天)换液,然后继续37℃培养至48h二感染后48h,按照流式细胞仪要求处理细胞,处理完细胞后通过流式细胞仪FL1通道测定绿色荧光,并根据结果计算病毒滴度TCID50/ml.
9.实时定量聚合酶链反应(Real-timePCR)检测Hela细胞表达大鼠CXCR4mRNA水平:取感染表达CXCR4基因慢病毒颗粒72h的Hela细胞(Hela-CXCR4)及传5代之后的Hela-CXCR4分别5x106个,磷酸盐缓冲液(PBS)悬浮,离心沉淀后加1mlTrizol,剧烈振荡以裂解细胞,提取总RNA并行RT-PCR,得到的PCR产物作为模板L4·,行Real-timePCR,引物分别为:甘油醛_3_磷酸脱氢酶(GAPDH):上游5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3',下游5'-TGGT-GAAGACGCCAGTGGA-3';CXCR4:上游5'-CATCT-TCTTGACTGGCATAGTGGGC-3’,下游5’-CTGCTGTA-AAGGTTGACGGTGTAG-3'.反应体系条件如下:第1步:95℃,5min,l个循环.第2步:95℃,30s;56℃,30s;720C30s;40个循环.第3步:720C,2min,1个循环.
10.Transwell小室观察细胞迁移:小室的直径为6.5mm,小室孔径为85N m分别将Hela细胞和Hela-CXCR4细胞置于小室上层,数量为1x10)个上层培养基为100闪,下层为600闪(分lJ}{加SDF'-1a0,50,100p,g/1.),细胞培养箱培养5h,上层未迁移到下层的细胞棉签擦掉,下层细胞用4%的多聚甲醛固定30min,结晶紫染色20min、在显微镜下分另}}取5个视野计数细胞迁移数量.
