核桃揪皮为胡桃科核桃属植物核桃揪的树皮·其树皮、根皮、叶片、未成熟外果皮及外壳均可人药.现代研究表明,核桃揪具有抗氧化,抗菌、消炎、抗诱变{"]和抗癌’5)等作用其含有多种抗肿瘤活性成分,如胡桃醒5伙榭皮素{和鞭花酸}l等报道胡桃醒可直接抑制体外培养肿瘤细胞的增殖.但其提取的其他活性部分临床研究报道较少.我们选用人肝癌细胞SMMC-7721作为研究对象,观察核桃揪树皮提取物的抗肿瘤效应,采用嚷哩蓝(M'1~I')法测定核桃揪皮甲醇提取液对SMMC-7721的抑制率.
一、材料与方法
1,材料:RPMI1640粉末(Gihc.公司);M'I`T(Simga公司);二甲基亚飒(天津北方天医化学试剂厂);5一氟尿嚓u;}(5-Fu,江苏恒瑞制药有限公司,批号08031021);小牛lfJl清(杭州四季青);胰蛋白酶(Gibc.公司);十二水合磷酸氢二钠(天津市恒兴化学试剂制造有限公司);磷酸二氢钾(沈阳市试剂厂);核桃揪树皮(采自黑龙江省牡丹江牡丹江峰);SMMC-7721瘤株(牡丹江医学院抗肿瘤研究所提供);酶标白动分析仪(美国MolecularDevices).
2.核桃揪树皮有效成分的提取:精密称取核桃揪树皮样品5009,以乙醚回流48h,剩余物以甲醇回流48h,旋转蒸发仪回收甲醇转水溶,过滤,浓缩,烘干,得到样品.
3.细胞培养:SMMC-7721细胞按常规培养在含有10%新生牛血清和青霉素、链霉素双抗的培养液中.培养箱温度为370C,CO:为5%,相对湿度为9801e.细胞单层贴壁生长,待长至80%左右备用(细胞发生融合时),用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗1一2次,再用含0.25%胰酶的消化液消化2一3min,收集对数生长期细胞用于实验_4.MTT法测定核桃揪提取液对SMMC-7721细胞增殖影响的检测:将对数生长期的SMMC-7721肿瘤细胞,常规消化成1x10}/L的单细胞,以1x10;个/孔接种于%孔板中,每孔加人100闪,培养48h后,弃去培养液,用PBS洗2次板,试药按浓度递增原则各设5个不同的浓度,最终质量浓度分别为200.0、100.0、50.0、25.0、12.5m扩L每种药的每种浓度均设5个平行孔,阴性对照组为等容积的16.10培养基阳性讨照组为X00m}-L}一Fn,在37U.5}7cC0,饱和湿度孵箱内培养条件下分别培养24,36,48h后,然后每孔加入5郭LMTT20闪显色,继续培养4h,吸弃培养液,每孔加人150闪二甲基亚矾(DNISO),终止培养,使用振荡器,震荡10min,使结屏物充分溶解,在酶标仪490nm处测定各孔的吸光度(1)值.
5.统汁学分析:应用SPSS15.0统计软件分析计量资料均以均数士标准差表示,组间比较采用t检验.
二、结果 结果表明,药物作用24h后,对SMMC-7721细胞的抑制作用随药物浓度的增加而增强,200一12.5m郭L各剂量组抑制作用与阴性对照组比较,差异均有统计学意义(Y<0.01),其中,200m舒I药物对SMMC-7721细胞的抑制作用最强,药物作用48h后,药物各剂量组的增殖抑制率与阴性对照组比较,差异均有统计学意义(P<0.01)其中,200m郭L药物对SMMC-7721细胞的抑制作用最强肿瘤生长的抑制显示在一定范围内核桃揪皮与肿瘤细胞之间存在着量效和时效的关系(即200m岁i」核桃揪皮抑制肿瘤细胞的作用最强)三、讨论 MTT显色法是当前评价肿瘤细胞生存较实用的一种方法.实验方法相对简便,所用时间较短.当肿瘤细胞在光镜一「未出现明显的外形变化时,其活细胞的线粒体内唬拍酸脱氢酶能还原MTT而形成难溶的蓝紫色结晶的产物,但死细胞并没有这个功能.用酶联免疫检测仪测定其吸收值在一定数量的细胞范围内,可以反映出活细胞的存活数量.MTT法对于临床合理用药、实现肿瘤患者个体化治疗具有重要价值.
我们在本研究中加人核桃揪皮提取物后对人肝癌SMMC-7721细胞具有明显的抑制作用,证实了核桃揪皮的抗癌作用通过不同浓度核桃揪皮的甲醇提取物进行体外的抗肿瘤实验,我们发现在12.5一200.0m郭L范围内肿瘤细胞增殖的速度减慢,细胞存活率有所降低,即抗肿瘤活性随浓度的增加和时间的延长而增强.
参考文献
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