岳桂平 译
华中农业大学 生命科学院
人类基因组计划所提供的大量数据,加速人类一些常见疾病机理的研究,帮助人们发现更多用于药物治疗靶蛋白。与此同时,具有抗靶蛋白活性的复合体的数量和多样性的也在逐步的扩展。生物和化学交叉结合的趋势推动在早期药物研发中应用,可靠快速的,选择性强,高通量筛选分析法。这种分析方法的典型特点就是可以自动扫描大量化合物,筛选针对一种既定的靶子或激活或抑制性的化合物。这种分析方法可以归为两类:无细胞筛选法(生物化学方法)和基于细胞筛选法(细胞学方法)。
在应用重组DNA和生物技术之前,药物研发通常是在不知道潜在靶分子的情况下,利用整个组织或细胞来筛选生物活性物质。随着蛋白质和基因鉴定技术的发展,以及对常见的人类疾病的分子机制认识的加深,一种以发生机制为基础筛选方法,也就是药物研发中用到的基于靶物质的药物研发方法,已经取代了传统的非特异性的化验方法。为了能够快速的分析不计其数的化合物对于他们特异性靶子的功能和作用效应,就发展了所谓的高通量扫描法(High-throughput screenings ,HTS)。
高通量扫描法通常被认为是一种很机械的方法,因此,应有的实验方法一般不要进行太多处理,样品被排列在小的容器中,例如在96孔板上,96孔板提供了一个可以自动鉴定的标准平台。许多非细胞依赖性的鉴定方法起初多数是用来鉴定纯化蛋白质的生化活性,这些蛋白质大多是酶类;而现在高通量扫描方法不需要将反应产物与底物分离就可以进行检测,很自然取代了传统方法。例如,荧光技术在无需分离或者纯化程序的情况下可以鉴定分子之间的反应,也可以鉴定酶活性。这些自动化鉴定方法保证了快速地扫描大型化合物库,可以鉴定出在体外对特异靶有生物活性的化合物(称为hits)。这些化合物经过化学修饰,再通过高通量筛选方法选择更特异有效的衍生物,称为先导化合物(lead compounds)。在传统药物研发过程中,应有细胞或者动物模型对这些这些先导化合物进行实验,以选择用于临床试验的药物。
近几年来,利用工程改造的细胞和微生物进行筛选的方法,也就是基于细胞筛选方法成为替代传统体外生物化学高通量鉴定方法中最具有吸引力的一个方法。这种体外检测方法需要弄清楚特定的靶分子所引发的特定细胞行为过程,而且还需要建立一种易于检测产物量的方法。越来越多的可以对细胞进行遗传改造的生物技术的建立使这种方法更容易了。
基于细胞筛选方法与体外筛选方法相比有很多显著的优点。第一,不需要纯化靶蛋白,因此就不必为获得一个具有生物活性靶子进行投资。随着可以用于治疗的药物靶子增多,这种优势越来越明显。因为,在自然底物未知的情况下很难建立一个针对成千上万的这些新蛋白的生化鉴定方法。第二,在细胞中靶蛋白的构象,活性以及生物学功能更接近于自然生理状态。第三,基于细胞筛选方法能够很快鉴定出拮抗性的化合物,这种化合物一般都是有细胞毒性的,或者是不能够跨过细胞膜达到细胞内靶子的化合物。因此,经过筛选得到的hits和先导化合物具有更高的可靠性。在药物研发过程中,这种方法可以节省时间和费用。
理想情况下利用人来源的细胞是最好的,因为人来源细胞提供最接近生理状态的模型系统。但是,在检测输出量的过程中其他多余加工产生的效应都很难控制,而且这些效应很难和所期望的针对特定靶特异性的效应区分开来。经过遗传修饰的哺乳细胞一般是值得怀疑的,又耗费时间。而且,培养人细胞一般费用都很贵,而且有时候在高通量筛选的自动化系统中很难繁殖。
微生物如酵母为在不同的细胞背景下(尤其是真核细胞)鉴定给定的人蛋白质,提供一种很简便的方法。在酵母中,人类蛋白能够组成性的表达。而且,可以营造一个好多方面都和人类生理条件很相似的环境,因为在人类细胞和酵母之间,一些基本的分子和细胞机制存在着高度的保守性。许多人类蛋白在酵母中具有功能,这表明在这种真核生物中,蛋白质具有所需的结构和稳定性,以及蛋白与蛋白质相互作用等等。尽管在人类细胞和酵母之间一些基础的细胞过程有高度的相似性,酵母和人类细胞还是有差异,不能得到完全相同的人靶蛋白,也会降低鉴定一些潜在的药物的可能性。因此,酵母也不是适用所有的人类靶蛋白。尽管这样,即使考虑到这些因素,人们仍然公认把酵母用于高通量筛选的细胞检测方法有许多不可替代的优点。
酵母优于哺乳动物细胞的一个主要的方面就是多样的遗传柔韧性,也正是这一特点使酵母在过去30年里成为了分子和细胞生物学研究优先选择的对象。酵母的这种特性以及酵母在遗传学和分子生物学方面多年的经验使得用酵母发展多种基因工具和细胞选择系统成为可能,而且也就很容易被转化用于高通量筛选。这些分子和细胞工具包括,高级的质粒系统,同源重组技术,以及选择易于筛选的标记。有营养型筛选如URA3, HIS3, LEU2和其它基因,有药物抗性(如kanr, natr)和药物敏感性(cyhr, GAL1, URA3)筛选以及比色筛选(如LacZ, GFP, Luciferase)等等。这种真核微生物用于高通量细胞筛选还有另外的一个优点就是培养和处理酵母的花费很低。而且,哺乳动物细胞多余的加工过程往往不能鉴定对靶分子一些特异效应,而酵母同源重组系统可以在一个嘈杂的背景中检测人蛋白质表达。尽管酵母有一个细胞壁包着而且它们的浆膜在某种程度上和哺乳动物细胞对应的部分也不完全相同,任何能够渗透进入酵母细胞的成分都可以进入人类细胞。很显然,细胞壁本身不能够限制小分子的渗透性,化合物的流出可能是降低细胞内化合物浓度的一个重要的机制而不是细胞膜的渗透性。在酵母中,很容易控制这个过程,而且可以通缺失过主要的ABC转运因子降低这种效应。
因此,在一个同源重组的真核生物体中和在遗传功能多样性的酵母的细胞环境中再现人类蛋白质的功能的可能性促使研究者利用工程化的酵母细胞建立一种靶特异性的高通量鉴定方法。
虽然非依赖细胞筛选方法有许多优点,但是细胞筛选方法提供了一个细胞环境,这种环境可以使的靶分子处于天然生理状态,而且化合物之间的相互作用也更加的精确。酵母易进行遗传操作和高度保守的基本分子机制,这些特性使这种真核微生物在靶特异性药物筛选中具有重要的价值。事实上,决定那种筛选方法最适合于高通量筛选特异性靶,依赖于靶分子的生物学和生物化学特性。