蛋白质组学已被广泛应用于疾病相关研究. 综述了最近几年来蛋白质组学在肝脏疾病研究中特别是肝脏肿瘤肝硬化毒/药物肝损伤等方面的进展, 其研究结果将对生物标记物和药靶的寻找, 以及致病机理的阐述具有重要意义.
关键词 蛋白质组学 肝脏疾病
随着人类基因组计划(HGP)的实施及人类基因组工作草图的完成, 生命科学研究在21 世纪初进入了功能基因组研究时代. 蛋白质组学研究在这一前沿领域中具有举足轻重的战略地位, 已被应用于生命科学的许多领域, 如肿瘤的发生与发展、细胞分化与胚胎发育基因调控机制
重大疾病的发生与治疗、药学研究和环境与健康的关系等. 蛋白质是理解细胞功能和疾病过程的核心, 没有在蛋白质组学方面的积极努力, 就不能获得基因组学的成果[1].
蛋白质组学概念及研究特点
蛋白质组学是一门以全面的蛋白质性质研究(如表达水平转录后修饰细胞内定位相互作用等) 为基础, 在蛋白质整体水平对疾病机理细胞模式功能联系等方面进行探索的科学.
与基因组研究相比, 蛋白质组研究存在明显的不同, 主要有以下几点: 基因组研究是对相对稳定的DNA 的静态研究, 而蛋白质组研究则是对细胞不同时期蛋白质表达的动态研究; 蛋白质更能反映细胞的功能, 磷酸化乙酰化糖基化甲基化和亚硝酰化等翻译后修饰和剪切的存在, 使得蛋白质组研究的信息量要多于基因组;基因组可通过PCR 扩增, 而蛋白质分析较困难, 特别是对动态表达的追踪和低丰度蛋白的分离鉴定, 因而, 蛋白质组学研究又在很大程度上依赖于相关技术的发展, 目前, 在双向电泳的基础上, 国际上又出现了以色谱/电泳-质谱为主要技术平台的生物大分子大规模分离和鉴定的技术与方法.
2 蛋白质组学在肝病研究中的应用
由于蛋白质组学研究更接近生命现象的本质, 并在药靶研究中具有潜在价值, 所以已被广泛用于疾病相关研究. 在肝脏研究领域, 蛋白质组学可用来研究肝脏的生理与病理肝脏发育及肝脏疾病等, 主要肝脏疾病包括肝脏肿瘤肝硬化毒/药物肝损伤及其他.
2.1 肝细胞癌
肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC) 是最主要的肝脏肿瘤, 约占原发性肝癌的90%以上, 早期诊断困难, 病程发展快, 5 年生存率小于5%. HCC 在肝硬化病人中有较高的发生率, HBV 和HCV 慢性感染亦是其发病的高危因素. 因此, 寻找有效的肿瘤标志物用于高危人群的筛查疾病的早期诊断药物靶标的设计及癌变机理研究成为HCC 研究的当务之急.
肿瘤标志物是存在于人体组织或体液中能被定量测量并对恶性肿瘤患者有临床意义的生物分子[2], 人们已在细胞组织样品和血清水平开展了这方面的蛋白质组学研究.
1. (1) 细胞水平: Seow 等人[3]对人肝细胞癌细胞系HCC-M 作了全谱分析, 对408 个点进行MALDI-TOF-MS 分析, 有301 个点得到了较好的质谱图, 经数据库检索鉴定出了属于192 个基因的272 种蛋白质. 这些蛋白质中除了一些看家基因外, 还出现了可能与肿瘤发生过程相关的蛋白, 如14-3-3 蛋白膜联蛋白抑制素和硫氧还蛋白过氧化物酶. 对其余29 种未鉴定的蛋白进行nESI MS/MS (nano- electrospray ionization MS/MS) 和de novo 测序, 全部得到鉴定, 其中包含已报道的肿瘤相关蛋白磷酸酪氨酸磷酸酶激活因子RNA 结合蛋白调节亚单位复制蛋白A 32 kD 亚单位和唾液酸磷酸合成酶[4]. 还发现一种新的核蛋白HCC-1[5], 其cDNA 水平在胰腺癌中上调, 在高分化肝细胞癌中也上调, 而在肿瘤细胞转入低分化状态时下调. 寻找HCC-1 相互作用蛋白RNA/DNA 的工作正在进行. 在以上工作的基础上, Liang 等人[6]建立了肝癌细胞系HCC-M 的蛋白质双向电泳数据库(http://proteome.btc.nus.edu.sg/hccm), 此外, 还将搜集其他肝癌细胞系
2. 正常肝组织和肿瘤组织的蛋白表达信息, 以确定早期诊断的标记物和肿瘤特异性治疗靶标.
Yu 等人[7]对比了人肝癌细胞系BEL-7404 和正常人肝细胞系L-02 的双向电泳结果, 在99 个差异点中鉴定出12 个蛋白点, 还将反义EGFR 的cDNA 序列转染肝癌细胞, 发现肿瘤细胞生长受抑, 与对照相比有40 个蛋白表达变化, 其中3 个蛋白有向正常细胞表达水平变化的趋势[8].
(2) 组织样本: Wu 等人[9]运用双向电泳技术对3 例正常肝组织和8 例HCC 肝组织的核基质蛋白进行对比分析, 鉴定出4 个HCC 特异蛋白, 认为这些核基质蛋白的发现可能为HCC 的发生发展发病机理研究提供新途径.
Yoon 等人[10]运用双向电泳技术对11 例HCC 肝组织及对应的非肿瘤组织核基质蛋白组分进行对比分析, 发现钙网硬蛋白在HCC 的核基质中大量存在, 此结果可被免疫杂交证实, 但两种组织中的钙网硬蛋白总量相似. 经免疫荧光显微镜分析, 发现肿瘤组织的核被免疫荧光染色. 钙网硬蛋白也在多种肿瘤细胞系的核基质中被发现, 其形成与增多可能与细胞生长活化有关.
Park 等人[11]对10 例HCC 病人的癌组织和邻近非癌组织进行双向电泳及MALDI-MS 分析以寻找新的HCC 标志物, 发现HCC 中出现人醛脱氢酶3 型(class 3 aldehyde dehydrogenase, ALDH-3)的3 种变异体, ALDH-2 的2 个变异体消失不见, 而ALDH-1 的4 个变异体保持不变, 且ALDH-3 与ALDH-2 变异体的相伴出现和消失在各例HCC 中均发生, 表明ALDH 同工酶变异体的变化可能与HCC 密切相关.
Lim 等人[12]对比了6 位Edmondson 级肝细胞癌病人自身的正常肝组织 .肝硬化组织和肝癌组织的蛋白质表达图谱, 找出了21 种在6 名病人中都有相同表达变化模式的蛋白, 其中肌氨酸脱氢酶 .肝羧酸酯酶肽基-脯氨酸异构酶A 和核纤层蛋白B1 在肝癌组织中的表达出现显著变化, 被认为是新的肝细胞癌候选标志物, 而核纤层蛋白B1 在肝硬化和肝癌组织中的表达逐渐上升, 被认为是肝硬化候选标志物.
为探讨HCC 中的铁缺失, Park 等人[13]运用双向电泳及MALDI-MS 对比分析19 例HCC 病人的癌组织和邻近非癌组织, 发现前者的铁蛋白轻链水平降低或无法检测到, Western blotting 和免疫组化也证实了相同的结果. 相反, 转铁蛋白受体在同一HCC 患者中表达水平上升. 有趣的是, 通过实时定量RT-PCR 发现铁蛋白轻链mRNA 与正常对照同水平, 提示翻译或翻译后修饰可能抑制了HCC 中的轻链水平. 基于PCR 的杂合子丢失分析, 表明只有一例患者在铁蛋白轻链定位的19q13.3-q13.4 区有染色体丢失, 说明轻链抑制现象不像是结构基因组变化所致, 从而在蛋白质组和基因组水平为HCC 发生中未解决的铁缺失问题提供了新线索.
(3) 血清: Steel 等人[14]运用蛋白质组学方法, 从处于疾病不同阶段的个体中采集血清经双向电泳分析来鉴定随病程变化的蛋白多肽, 证明血清多肽数量的变化及翻译后修饰的变化(如聚糖结构的变化)可用于HCC 的诊断和进展评估.
Le 等人[15] 搜集了37 名HCC 患者31 名慢性HBV/HCV 感染而无HCC 的患者143 名对照(116 名其他肿瘤患者3 名SLE 患者24 名健康人)的血清, 将肿瘤细胞系蛋白经双向电泳分离后与血清进行Western blotting, 发现8 种蛋白的抗体在大于10% 的HCC 患者血清中检测出而健康个体中没有, 其中4 种蛋白在慢性肝炎病人血清中有相对较高的检出率, 而另4 种蛋白的抗体主要在HCC 患者血清中检出. 认为抗体检测可用于HCC 的诊断以及HBV 和HCV 慢性携带的高危人群的筛查.
Poon 等人[2]利用双向电泳分离HCC 病人以及肝硬化病人和正常人的血清, 经分析发现包括AFP 在内的20 多种蛋白出现HCC 特异性的上调或下调表达. 在HCC 组及对照组50%的个体中出现的点被用于对比分析, 保证了无偏性地反映HCC 特异性的蛋白质组特征; 使用荧光染色及成像技术, 不仅可获得较好的线性范围, 而且更适用于通过对比分析以确定血清中含量甚微的肿瘤标志物(mg/mL, ng/mL 甚至pg/ mL), 并且对比了肿瘤切除前后的血清, 以验证新发现的标志物. 血清中大量存在的白蛋白尚需提前去除以防干扰, 肿瘤标志物被验证后, 还需进一步的确认和更大样本量的临床研究.
2.2 肝硬化
肝硬化是一种或多种病因长期或反复作用造成的弥漫性肝脏损伤, 其中肝星状细胞的活化是启动肝纤维化进程的关键环节. 受损的肝细胞
邻近的内皮细胞枯否氏细胞以及肿瘤细胞和血小板都可激活肝性状细胞, 促其合成大量细胞外基质[16]. 因此, 肝性状细胞也成为肝硬化相关的蛋白质组学研究的目标.
Kawada 等人[17] 通过对大鼠星状细胞的蛋白质组分析, 发现了一种新蛋白STAP(stellate cellactivationassosiated protein). 它只在星状细胞中检测到, 在纤维化肝中分离到的体内激活星状细胞和体外原代培养的活化星状细胞中高表达, 可能通过清除过氧化物发挥抗肝纤维化的作用.
Kristensen 等人[18] 对比静态和激活的大鼠肝星状细胞, 发现有27 种蛋白在体内和体外激活的星状细胞都有相同表达变化, 其中钙周期蛋白, calgizzarin, galectin-1 上调, 肝羧酸酯酶10, 丝氨酸蛋白酶抑制物3 下调. 还列出了150 余种星状细胞蛋白, 从而加深了在蛋白质水平对星状细胞活化这一肝纤维化关键事件的认识.
2.3 毒/药物肝损伤
肝脏具有重要的解毒功能, 在生物异源污染物的生物转化药物代谢中发挥重要作用. 但当毒物的摄入超过肝脏的代偿能力后, 会对肝脏造成损伤. 蛋白质组学已被用于阐明毒物导致肝损伤的作用机理, 并为毒物的早期确定提供毒理学标记物.
过氧化物酶增殖因子(peroxisome proliferators, PPs) 可引起肝细胞增殖抑制调亡, Chevalier 等人[19] 对比大鼠肝原代细胞在过氧化物酶增殖因子nafeno-pin 和EGF 作用下蛋白表达变化模式的不同, 找出了毒蕈碱类乙酰胆碱受体3, 中间丝波形蛋白和ATP 合成酶b亚基等32 种nafenopin 诱导的蛋白, 用于进一步阐明PPs 的致癌机理, 并为非遗传毒性致癌物的早期确定提供了毒理学标记. Macdonald 等人[20] 通过比较野生型和PPs 激活受体? 无效小鼠在PPs 作用下的蛋白表达, 找出18 种差异蛋白, 其中包括有抗凋亡作用的葡萄糖调控蛋白94 的组成性过表达, 为PPs 激活的抗凋亡机制研究提供了思路.
Zeindl-Eberhart 等人[21] 对N-methyl-N-nitrosourea, diethylnitrosamine 和N-nitrosomor-pholine 等3 种基因毒性亚硝基化合物及非基因毒性nafenopin 致大鼠肝癌进行蛋白质组分析, 发现两种肝特异性酶3?-羟基类固醇脱氢酶和d-3-甾酮-5b还原酶在各种毒物所致肝癌中都有上调表达. Witzmann 等人[22] 对喷气机燃料蒸汽的大鼠肝毒性进行了蛋白丰度和蛋白电荷修饰指数分析. Tonge 等人[23] 运用荧光双向差异电泳蛋白质组技术分析了扑热息痛处理的小鼠肝组织表达变化. 此外, 蛋白质组分析还被用于酒精退热净[25] 嘧啶衍生物[26] SKF-106689 [27] 和洛伐他丁[28] 等对肝脏影响的研究.
2.4 其他
蛋白质组学还被用于研究Huntington’s 病不同组织在病程发展中的蛋白表达变化[29] 以及肝片吸虫的分泌物与宿主免疫逃避[30]等.
3 结语
蛋白质组学研究在最近几年得到了飞速的发展, 已被广泛用于疾病相关研究. 但肝病相关蛋白质组研究现多集中在以2DE 和质谱为基础的差异分析上, 2DE 对低丰度高疏水性蛋白的分析有一定的限制, 将各种新的差异分析技术(ICAT, SELDI, LCM 和多维色谱等)引入到差异分析中来, 寻找更多有意义的肝病诊断标志物和与致病机理相关的蛋白, 将是今后发展的方向, 此目标的实现依赖于分析规模分辨率(尤其对于低丰度蛋白)和重复性的提高. 临床需求与实验室研究的结合亦很重要. 蛋白质组学亚洲和大洋洲人类蛋白质组组织(Asian and Oceanian Human Proteome Organization, AOHUPO) 已于2002 年3 月宣布启动人类肝脏蛋白质组计划(Human Liver Proteome Project, HLPP), 同年10 月22 日成立了中国蛋白质组组织(China Human Proteome Orgnization), 并召开了人类蛋白质组组织肝脏专题讨论会. 肝病在我国有较高的发病率, 我们更应抓住这一契机, 利用蛋白质组学研究的技术与方法进行相关的基础研究与应用研究.
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