暨南大学 移植与免疫中心
基因组测序以及随后的DNA阵列试验的兴起已经获得大量有关基因序列，组装和表达的信息。因而人们期望能对基因组编码的所有蛋白进行类似的系统研究。特异抗体库或其他配基库将是必备的工具。由于传统免疫方法不可能产生足够数量抗体，所需纯度以及重复性也不能满足要求，因而人们将需要应用体外抗体选择方法。
完整基因组测序或者草图已经在越来越多的生物中完成，这包括人，酵母和其他一些种类（微生物基因组列表见www.tigr.org/tigr-scripts/CMR2/CMRHomePage.spl）。基因组测序完成使科研人员可以进行基因组水平研究，对酵母的研究最深入透彻。之所以对酵母研究这么深入，主要是因为在酵母中容易通过同源重组把内源性基因替换成修饰过的基因。然而，在多数生物中很难利用这一强大技术，将表达标签连到每个基因产物上。唯一的方法就是筛选所有基因产物的特异结合配基。在传统方法中应用的结合配基是抗体，如蛋白质印迹，流式细胞术，免疫沉淀反应，免疫荧光，免疫组织化学和纯化，只不过过去是分析单个基因，而现在则是分析蛋白质组。除了这些用途以外，结合配基还可用于新的蛋白质组技术，如抗体芯片和生物传感器。
传统方法使用的抗体，有多克隆抗体和单克隆抗体。多克隆抗体通常使用蛋白，结合肽或DNA表达载体免疫动物获得。多克隆血清中的不同抗体可以识别单一抗原，实用性很强（多克隆抗体能在许多实验中应用），但重复性差（每个多克隆血清即使来自同一动物，也是特异的，不可重复的）。引进杂交瘤技术可以消除多克隆抗体交叉反应和背景的问题，并且产生大量确定特异性的单克隆抗体。然而，尽管非常有用，但单克隆技术很难在高通量技术中应用，也存在毒性和免疫原性差的问题。所以采用一套新的技术，通常称为生物分子多样性（biomolecular diversity）或生物分子展示技术是很必要的。
概括起来讲，这种技术就是从大型配基库中筛选特异配基，主要包括几个步骤，每步都有一些共同的特征（见表一）。通常需要进行2-3次重复才能直接扫描到合适的结合配基。如果这个配基库的质量很好，通常所有的靶都能找到合适的配基。生物分子多样性技术的第一个例子是肽，使用的技术是噬菌体展示技术，肽被连接到丝状噬菌体一种衣壳蛋白上。这个平台技术用来鉴定单克隆抗体结合抗原决定簇。除了噬菌体展示之外，细菌和酵母也被用作微生物展示技术，而核糖体展示和嘌呤霉素展示（mRNA或cDNA直接与它们编码的多肽相连）在体外也被应用。
所有这些都是物理选择方法，需要大量选择因子（selector？？？）完成扫描和筛选。一些遗传学方法也被用于筛选特异性结合配基。这些方法不需要选择因子，而是依赖原位合成以及配基与靶分子之间的相互作用。酵母双杂交系统和蛋白互补实验已经用于模式系统筛选scFv，不需要抗原合成和纯化就能进行选择。
不同基因组计划处于不同研究阶段，因而没有一个方法适合所有基因组。如果有纯化的蛋白质，物理筛选方法将非常有效。如果仅有基因组序列是可用的，依赖配基与靶之间相互作用的遗传筛选方法可能更有效，它不需要纯化蛋白质。然而无论使用那种方法，鉴定所选抗体特异性总是一个重点和难点。
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物理筛选方法
运用物理方法选择靶蛋白相应结合配基，所用的选择因子需要经过纯化。有两种常用物理选择方法：第一种，抗原固定到固体支持物上，与抗体库一起温育，待抗体与抗原识别并结合之后，将非结合抗体冲洗掉，再将特异抗体洗脱收集；第二种方法就是，标记抗原（常用生物素或荧光标记），然后筛选与之特异结合的抗体。在噬菌体，细菌和酵母展示技术中，活的生物体用于扩增和展示并将表现型，基因型结合起来；而核糖体和嘌呤霉素mRNA展示技术依赖PCR扩增，RNA体外翻译获得配基，接着分别以非共价键和共价键结合到相应cDNA。这些方法通常需要几轮筛选。最近已经建立了大型天然酵母展示库，根据亲和力筛选某靶的特异抗体效果与噬菌体库一样好。
应用物理筛选方法的主要瓶颈是要得到足够数量的抗原来进行筛选和扫描。有两个基本筛选和扫描方法：基于基因和基于蛋白质组。基因筛选方法中，选择因子特性是预先知道的，获得的抗体特异性是明确的。合成肽，多肽片段或重组全长蛋白是适宜的选择因子。蛋白质组筛选方法使用的是天然成分（如组织或细胞抽提物）。获得的抗体所识别抗原的特性需要鉴定。在2D凝胶电泳分离之后，蛋白质转移到PVDF膜上，用噬菌体抗体进行筛选。尽管可以使用天然蛋白进行筛选，高通量扫描和鉴定适宜的结合配基仍是个关键问题，还是需要得到足够数量的选择因子。举个例子，一些蛋白在血清中浓度是1 pg /ml,至少需要纯化1000升才能得到1ug。基因筛选方法最大优点就是抗原特性预先知道，因而可以得到足够数量的抗原；而蛋白质组最大的优点就是抗原是处于天然状态，保留翻译后修饰的特征。
噬菌体和酵母展示
噬菌体展示技术已经广泛应用于选择抗体。克隆大量不同抗体基因于衣壳蛋白3基因的上游，噬菌体或噬菌粒作为展示载体，建立了噬菌体抗体库。大多数噬菌体抗体库是使用scFvs作为抗体形式，有报道一个大型Fab 库也已经建立了。抗体基因克隆于基因3的上游区，抗体与基因3衣壳蛋白组成融合蛋白。噬菌体抗体库理论上含有1011种（这是通过计算独立克隆数得到的）。抗体库多样性是受到细菌转染效率限制的。VH和VL基因克隆之后用cre重组酶进行基因重组，通过这种方法可以建立一个大得多的抗体库。
从天然噬菌体抗体库筛选的抗体表达水平有很大差异（从10ug/L到20mg/L），能够被诱发高水平表达。现在已经知道（至少在酵母中是这样），scFv稳定性，表达和展示是相关的，改进任何一个参数很可能同时提高其它参数，这意味着增加scFvs细胞内稳定性的一些方法可以增强表达。
体外展示系统
这种方法是在翻译之后，将基因与它们所编码的蛋白相连。在RNA展示中，嘌呤霉素将RNA与它们所编码蛋白共价相连，在核糖体展示中核糖体自身就是基因和蛋白的连接体。初步筛选得到的scFvs与从噬菌体抗体库筛选的scFvs亲合力相似。噬菌体展示技术经过2-3轮筛选可以得到阳性克隆，而体外展示技术则需要更多轮筛选。尽管需要更多轮筛选，然而体外展示技术可以得到pM亲和力的抗体，也能进行高通量筛选。选定之后，抗体或其它结合配基通常克隆到细菌表达系统中，体外翻译系统目前还没有使用过。并不是所有体外展示筛选的抗体都能很好的在细菌中表达，这是一个很大的瓶颈。
遗传筛选方法
如果有物理筛选因子，物理方法是筛选结合配基一个很好的办法。这个领域发展很快，一些研究小组已经在基因组水平得到少量蛋白质，然而在大多数蛋白质组计划中都缺乏足够数量的选择因子。一个途径是避免全部使用物理筛选因子，建立遗传筛选方法，使用编码全部或部分目的基因DNA序列。从库中筛选结合配基的本质是蛋白质与蛋白质之间的相互作用，酵母双杂交系统是使用最广泛的遗传筛选手段鉴定这种相互作用。在理想条件下，克隆目的基因作为"诱饵"，转染抗体库进行筛选。然而目前大多数抗体库包含50亿多个克隆，这远远超过酵母转染能力。所以需要进行一轮初筛选，将目的蛋白克隆到酵母双杂交载体中。这可以降低文库多样性至105-106，允许筛选不同scFvs,但它在进行遗传选择之前还是需要物理选择因子。而且，在遗传筛选方法中，大多数scFvs在细胞内环境中是没有功能的，因为它们需要二硫键保持稳定，这在还原性的细胞质环境中是不能形成的。
遗传筛选之前可以通过细菌遗传系统或蛋白互补实验进行物理筛选。细菌遗传系统依赖转录活化作用而蛋白互补实验中细胞存活所必须的酶（如二氢叶酸还原酶或b-内酰胺酶)分成两部分，只有当两部分组合在一起才有活性。当存在两种相互作用的因子如抗原与抗体，这两个部分可以组合起来酶就具有活性。用模式抗体和DHFR进行的预实验表明特异抗原抗体相互作用使细胞更容易存活，比非特异作用效率高107倍。这种方法与Escherichia coli高水平转染效率方法结合起来在蛋白质组水平筛选抗体非常有用。
大多数细菌系统也需要抗体在细胞质内稳定，因为除了b-内酰胺酶，它们都参与细胞质作用。尽管通过适当突变和筛选可以显著增加任何抗体的稳定性，但建立结合配基库更适宜。库中多数结合配基在细胞内条件下是有功能的，而不需要优化单个scFvs。这样的库还没有建立起来。最近的研究表明接上一个麦芽糖结合蛋白C端，scFvs在细胞质内可以保持稳定以及而且可以高水平表达。
使用b-内酰胺酶实验筛选抗原-抗体相互作用与DHFR类似，不需要利用在细胞内稳定的抗体库，因为这种酶在外周胞质具有活性。然而它需要抗原分泌到外周胞质，细胞质抗原在这些条件下是不稳定的。结果，遗传筛选方法需要有几种可行的方法，这依赖于抗原特性。亲和筛选法也有同样要求，这种方法将遗传和物理筛选方法结合起来，需要抗原和噬菌体抗体在外周胞质共表达。在一轮传统噬菌体展示选择之后，抗原抗体在外周胞质相互作用，利用过滤法扫描阳性克隆，这种技术已经鉴定许多不同抗体。
目前有一些不同方法用于高通量筛选基因产物抗体。决定那种方法适合特异基因组依赖于是否有纯化的选择因子（蛋白质或片段）。如果有物理筛选方法（噬菌体展示，酵母展示和核糖体展示）是非常适宜的。如果缺乏纯化的选择因子，可以使用多肽或者遗传筛选方法，尽管两个方法在技术成熟性和操作简便性远远不及物理筛选方法。
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