2010年12月9日，我所王晓晨实验室在PLoS Genetics杂志在线发表题为“Endocytic Sorting and Recycling Require Membrane Phosphatidylserine Asymmetry Maintained by TAT-1/CHAT-1”的文章。该文章首次报道了秀丽线虫磷脂酰丝氨酸转运蛋白TAT-1及其分子伴侣CHAT-1通过维持磷脂酰丝氨酸在内涵体膜上的不对称性分布从而调控细胞内有效的内吞分选(endocytic sorting)及循环(recycling)过程。
早期内涵体(early endosome)是细胞内的“货物分选站”。内吞分选是早期内涵体(early endosome)通过形成若干形态与功能各异的亚结构而实现的。已知需要被循环利用的蛋白如某些受体等在早期内涵体将被分选而转运到新形成的管状膜泡上，从而回到细胞膜上继续行使其功能，而这种内吞循环过程中的管状膜泡的形成是如何被调控的还知之甚少。我们的工作表明，秀丽线虫磷脂酰丝氨酸转运蛋白TAT-1及其分子伴侣CHAT-1对于这种管状膜泡的形成至关重要，而该功能很有可能是通过维持早期内涵体膜上磷脂酰丝氨酸的不对称性分布而实现的。
我们从一个调控凋亡信号磷脂酰丝氨酸外翻缺陷的遗传筛选中得到了编码磷脂酰丝氨酸转运蛋白TAT-1及其分子伴侣CHAT-1的功能失活突变体。TAT-1属于P类ATP水解酶家族，这类蛋白与生物膜上磷脂酰脂类的分布调控相关。在野生型的凋亡细胞表面可以检测到磷脂酰丝氨酸的暴露，这是凋亡细胞早期最显著的凋亡信号，而在活细胞表面磷脂酰丝氨酸都被限制在细胞膜内侧。在tat-1和chat-1突变体中，在凋亡细胞和活细胞表面我们都可以检测到磷脂酰丝氨酸，这与之前薛定实验室关于TAT-1的研究结果是一致的。我们发现TAT-1与CHAT-1在多种细胞类型中共定位，在亚细胞水平上，它们在细胞膜和细胞器膜上也共定位。进一步研究表明，它们需要彼此才能从内质网被运输到细胞器膜和细胞膜上执行功能。这是首次对秀丽线虫中TAT-1分子伴侣CHAT-1的研究报道。
这两个突变体除了具有磷脂酰丝氨酸在活细胞表面暴露的表型之外，研究发现在幼龄四期线虫及成虫的肠系细胞中累积了很多异常变大的膜泡。通过一系列内吞系统的分子标记分析表明这些膜泡上具有早期内涵体蛋白RAB-5，晚期内涵体与早期溶酶体蛋白RAB-7，以及循环内涵体蛋白RAB-10和RAB-11。hTfR、hTAC和GLUT1(线虫葡萄糖转运受体)是细胞膜表面受体，在野生型中这些蛋白在内吞发生后会较快地被转运回到细胞膜上，因此它们主要定位在细胞膜上，而在突变体中这些蛋白很大比例滞留在细胞中，细胞膜上的定位大大减少。线虫通过降解卵黄蛋白为发育提供营养，突变体的胚胎和成虫与同时期野生型相比，有明显的卵黄蛋白降解缺陷。此外，在肠系细胞中有较多的细胞自噬(autophagy)蛋白LGG-1聚积，表明细胞自噬的降解可能也有缺陷。
为了深入研究为何突变体中存在内吞循环缺陷和降解缺陷，我们检测了TAT-1和CHAT-1在肠系细胞中的亚细胞水平定位。TAT-1和CHAT-1主要定位在细胞膜，早期内涵体及管状膜泡的细胞器膜上。与RAB-5、RAB-10和RAB-11的共定位研究表明这些管状膜泡是从早期内涵体发出的循环内涵体。已知RAB-10促进循环内涵体的生成，RME-1促进循环内涵体顶端形成球状膜泡并脱离管状膜泡。在rab-10突变体中，观察不到CHAT-1标记的管状膜泡；而在rme-1突变体中，管状膜泡比野生型中更加明显。这些结果进一步证实TAT-1和CHAT-1标记的管状膜泡是循环内涵体。检测CHAT-1和GLUT1的共定位发现，二者在管状结构上很好的共定位，表明CHAT-1所标记的循环内涵体上具有循环转运GLUT1的功能。在tat-1和chat-1突变体中，观察不到这种GLUT1标记的管状膜泡，与此同时GLUT1很大比例无法被循环运送到细胞膜上。
已有研究表明，TAT-1负责调控细胞膜上磷脂酰丝氨酸不对称性分布。而细胞器膜上磷脂酰丝氨酸是否不对称性分布，如果不对称性分布，那么是否由TAT-1调控均无研究报道。通过特异结合磷脂酰丝氨酸的LACT-C2分子标记，我们发现在肠系细胞包括早期内涵体、循环内涵体在内的多种细胞器膜外表面有磷脂酰丝氨酸分布。线虫六个假体腔细胞有较大的内涵体和溶酶体，我们通过分泌的LACT-C2发现野生型内涵体膜内侧无磷脂酰丝氨酸分布，而tat-1和chat-1突变体中能检测到！以上结果表明，磷脂酰丝氨酸在内涵体膜上是不对称性分布的，而这种不对称性分布是由TAT-1和CHAT-1参与调控的。这是关于内涵体膜磷脂酰丝氨酸不对称性分布及其调控的首次研究报道。我们认为，TAT-1和CHAT-1维持了内涵体上磷脂酰丝氨酸的不对称性分布，而这种不对称性分布对于细胞内有效的内吞分选和循环是至关重要的。
我所与北京协和医学院联合培养的博士生陈宝惠为本文的第一作者，其它作者还有姜岳、曾胜、晏家骢、李欣、张燕和邹炜。王晓晨博士为本文通讯作者。此项研究由科技部863计划和北京市科委资助，在北京生命科学研究所完成。（生物谷Bioon.com）
生物谷推荐原文出处：
PLoS Genetics doi:10.1371/journal.pgen.1001235
Endocytic Sorting and Recycling Require Membrane Phosphatidylserine Asymmetry Maintained by TAT-1/CHAT-1
Baohui Chen1,2, Yue Jiang2, Sheng Zeng2, Jiacong Yan2, Xin Li2, Yan Zhang2, Wei Zou2, Xiaochen Wang2*
1 Graduate Program in Chinese Academy of Medical Sciences and Peking union Medical College, Beijing, China, 2 National Institute of Biological Sciences, Beijing, China
Abstract
Endocytic sorting is achieved through the formation of morphologically and functionally distinct sub-domains within early endosomes. Cargoes destined for recycling are sorted to and transported through newly-formed tubular membranes, but the processes that regulate membrane tubulation are poorly understood. Here, we identified a novel Caenorhabditis elegans Cdc50 family protein, CHAT-1, which acts as the chaperone of the TAT-1 P4-ATPase to regulate membrane phosphatidylserine (PS) asymmetry and endocytic transport. In chat-1 and tat-1 mutants, the endocytic sorting process is disrupted, leading to defects in both cargo recycling and degradation. TAT-1 and CHAT-1 colocalize to the tubular domain of the early endosome, the tubular endocytic recycling compartment (ERC), and the recycling endosome where PS is enriched on the cytosolic surface. Loss of tat-1 and chat-1 function disrupts membrane PS asymmetry and abrogates the tubular membrane structure. Our data suggest that CHAT-1 and TAT-1 maintain membrane phosphatidylserine asymmetry, thus promoting membrane tubulation and regulating endocytic sorting and recycling.
