急性脑缺血动物模型实验研究进展
刘红梅 高天明 佟振清
摘要 脑血管疾病是人类发病率最高的疾病之一，模拟临床疾病，研制较为可靠的脑缺血动物模型因而显得尤为重要。本文着重介绍了常用啮齿动物全脑和局部脑缺血模型的种类、制作方法及特点，对系统研究脑血管疾病的发病机理、病理、生理学改变，以及药物疗效、防治措施等，在实验动物模型的选择方面，具有一定指导意义。
关键词：脑缺血 模型 啮齿动物
脑血管疾病是人类发病率最高的疾病之一，而且常导致病人残疾。人类缺血性脑卒中在其病因、临床表现、发生部位有很大变化，其严格的病理组织、生化及生理学研究常需借助侵入性外科手术，从而直接摘取脑组织。而且脑缺血最初几秒至几分钟的缺血损伤研究，只能依靠实验动物来完成。另外，缺血是不正常的血液灌流，因而需要脉管系统的参与，而体外培养的组织或细胞缺乏这一重要特征。因此，模拟临床疾病，制作较为可靠的脑缺血动物模型，对系统研究其发病机理、病理、生理学改变，以及药物疗效、防治措施等，都具有重要指导意义。
1 啮齿动物脑缺血模型的科研价值
尽管一些体积较大的动物，如猫、狗、兔都曾用于脑缺血研究，但是大多数实验室选择大鼠或沙土鼠作为研究对象。这是因为：(1) 大鼠品种多，易于饲养，价格低廉；(2) 纯种鼠属近亲交配，基因型相似，脑血管解剖和生理机能也相似；(3) 大鼠脑血管解剖和生理机能接近于人类；(4) 脑血管损伤部位恒定，实验重复性好；(5) 动物存活时间长，利于脑缺血相关病理改变过程的研究；(6) 脑体积大小适宜，易施低温固定技术和组织生化分析；(7) 有关系列大鼠的生理、药理和生化方面的实验资料可供分析比较；(8) 克服了体外实验无法实施再灌流的缺陷。(9) 沙土鼠缺乏后交通动脉及完整的基底动脉环，两侧大脑供血相对独立，通过闭塞一侧或双侧CCA即可复制效果明显的同侧或双侧脑缺血模型。
2 常用全脑缺血模型
2.1 两血管闭塞法 Smith等[1]通过夹闭双侧颈总动脉(CCA)合并低血压以减少脑血流量，造成急性脑缺血。脑组织缺血程度可以通过测定脑血流量(CBF)反映出来。啮齿动物(沙土鼠除外)脑血液循环有较人类丰富的侧支循环,仅结扎双侧CCA不足以明显降低 CBF，必须结合降压药三甲噻吩、酚妥拉明等降低动脉血压至6.7 kPa，使CBF降低至正常的5％～15％。采用这种方法复制的模型，能进行缺血再灌流损伤的研究，模拟了临床上休克、心功能不全、脑血管严重狭窄或阻塞合并血液低灌流引起的脑循环障碍，造成不同程度的脑组织缺血损伤。因而，对于探讨人类缺血性脑损伤的发病规律，评价抗脑缺血药物的疗效等有价值。缺点是：(1) 模型不能在清醒动物上复制，无法研究血管狭窄后行为学的变化；(2) 脑缺血时限长，有时导致脑缺血后抽搐、癫痫等并发症的发生。
2.2 四血管闭塞法 Pulsinelli 等[2]在1979年通过阻断双侧CCA及椎动脉血流成功建立了四血管闭塞法大鼠全脑缺血模型。手术分两个阶段：麻醉动物，颈前正中切口，分离CCA，将无损动脉夹轻放于双侧CCA周；同时枕部切口暴露第一颈椎翼小孔，电凝双侧椎动脉，造成永久性闭塞。24 h后夹闭双侧CCA，造成明显的脑缺血。以大脑皮层、纹状体、海马缺血最为明显。解除动脉夹可进行脑缺血再灌流研究。1983年，作者又改进这一模型，即在气管、食管、颈总动脉、颈外静脉后，颈部肌肉前置一手术丝线，夹闭CCA同时，在气管后扎紧这根丝线，以减少颈部皮下组织、肌肉血液对脑部的供应[3]。这种模型的优点是：检验缺血是否成功的指标明确[2]；可进行再灌流损伤的研究；海马损伤明显，可显示记忆功能的减退。缺点是：手术较复杂，实验操作的熟练程度直接影响实验效果。
2.3 沙土鼠脑缺血模型 沙土鼠缺乏后交通动脉及完整的基底动脉环[4]，因而结扎单侧CCA即造成明显脑缺血，被广泛用于中风病理机制研究。手术操作简单，创伤小，可用于筛选脑活性保护成分或缺血性保护剂的研究。缺点是：(1) 沙土鼠体积小，生理反应有不稳定倾向，操作技术要求高；(2) 中风发生率较高，在CCA夹闭过程中，需保持动物清醒，便于随时观察动物生理状态变化。
2.4 其它
2.4.1 颅内加压法 小脑延池内注入人工脑脊液，使颅内压升高超过动脉血压2.7～9.3 kPa，同时给予神经节阻滞剂三甲噻方，防止颅内高压反射性引起高血压。
2.4.2 颈部加压法 麻醉动物，颈部套一止血带，加压至80～93 kPa，减少脑血流量，造成脑缺血。
2.4.3 断头法 断头造成全脑不可逆缺血，取下脑组织冰冻贮存，常用于生化和代谢分析。
2.4.4 低氧法 结扎单侧CCA合并全脑缺氧，PaO2维持在2.8 kPa。由于脑部不是真正的缺血，采用这一模型得到的结论不适用于脑缺血，但可比较缺氧与脑血流量减少引起效应的不同。
2.4.5 胸内血管夹闭法 开胸，夹闭左侧CCA、头臂干、左侧锁骨下动脉，造成全脑缺血。
3 常用局灶性脑缺血模型
大脑中动脉(MCA)是人群脑卒中的多发部位，MCA闭塞模型被普遍认为是局灶性脑缺血的标准动物模型，主要有以下几种：
3.1 开颅法 Tamura 等[5]采用颞下部开颅，分离近端MCA，电凝或用手术丝线结扎MCA，造成脑梗塞，是目前公认的标准MCA闭塞模型。以大脑皮层、尾状核缺血最明显。近年来，这一模型又得到进一步改进。降低动脉血压以减少伴行血管远近端分支对梗塞区的血供，增大了梗塞面积[6]。Kader改进了电凝方法，闭塞MCA所有可见分支，梗塞效果好。Chen等[7]采取鼻缝旁入路，制作了远端MCA合并同侧CCA永久性闭塞，对侧CCA暂时性闭塞模型。开颅法闭塞MCA，实验条件较恒定，缺血效果可靠，是迄今应用最广泛的经典性局灶脑缺血模型。其缺点是：需要开颅，创伤性大，闭塞血管后无法进行再灌性损伤研究。
3.2 光化学法 Watson等[8]首次建立了光化学法诱导脑皮层梗塞的动物模型。立体定位仪固定大鼠头部，暴露颅骨，尾静脉注射光敏材料荧光素，用560 nm波长的特定光源照射局部头颅，光线透过颅骨与血管内的染料接触，激发光化学反应，引起照射部位皮层血管内皮细胞毒性脑水肿而导致脑梗塞[9]。此法适于研究抗血小板、抗血栓形成药物和血管内皮细胞保护剂的疗效。这种模型无须开颅，动物存活时间长，适于慢性脑缺血研究；而且皮层梗塞部位可任意选择，为皮层功能定位研究提供了条件。但它与人类常见的脑栓塞存在差异，而且是终末动脉永久性闭塞，妨碍扩血管药的治疗观察。
3.3 栓塞法 颈动脉注射血凝块栓子复制栓塞性脑卒中模型的方法过去只用在大体积动物，现已在大鼠上得到应用。Kudo等[10]采用<100 μm的同源血凝块栓子悬液，注入CCA，在颈外动脉（ECA）的颈内动脉（ICA）开口处置一可逆性插管，栓子则由ICA进入MCA，导致同侧大脑皮层、海马、深层灰质结构的梗塞。也有人用碳素颗粒、 花生四烯酸钠作为栓塞剂制成脑梗塞模型。适于血栓形成过程的研究和溶栓治疗的观察，尤其是人血凝块栓塞者更具有应有价值。缺点是：（1）由于栓子的随机性，无法预测梗塞部位及大小；（2）侧支循环的影响使组织缺血程度不一，不利于组织定量分析。
3.4 插线法 分离暴露颈部血管，4-0尼龙线从ECA或CCA分叉处插入，进入ICA，阻断MCA起始端及其所有侧支血流循环，导致MCA局灶缺血。轻轻提拉插线，有阻力时提示丝线头端已达ECA或CCA切口处，制成再灌流模型。可将尼龙线头端烧成鼓槌状[11]，也可在尼龙线远端涂一层硅酮弹性体(长度5 cm,直径0.25 mm)便于插入ICA并胀紧血管[12]。通过实践测量发现，插线深度17 mm时，腔内线头一般刚到或接近MCA分支处，信照亮[13]提出腔内线插入深度应达19～20 mm，并认为翼腭动脉是否结扎对脑梗塞的影响不显著，从而简化手术操作，减少创伤出血。这种模型无须开颅，MCA闭塞效果较理想，是目前能进行再灌流损伤研究的较理想局部脑缺血模型。缺点是：（1）结扎枕、甲状腺上、咽升、舌、上颌外和翼腭动脉需要一定手术技巧；（2）属栓塞性脑卒中，与人群常见的脑卒中存在差异。
4 小鼠脑缺血模型
近年来，一些作者又建立了小鼠全脑和局部脑缺血模型。通过结扎双侧CCA后再解除动脉夹，可复制出小鼠全脑缺血再灌流模型[14]。1987年，Welsh等[15]建立了插线法小鼠局部脑缺血模型。也可用双极电凝针永久性闭塞MCA。小鼠脑缺血模型多用于脑组织生化代谢、评价药物疗效方面的研究。由于动物体积小，常需借助手术显微镜，应用不太广泛。
5 脑缺血损伤的影响因素
5.1 血糖浓度 高血糖可加重脑损伤[16]，增加梗塞面积1.4倍。原因是葡萄糖无氧代谢乳酸大量堆积而导致组织酸中毒，而且在不完全脑缺血中这一作用尤其明显，因为有更多的葡萄糖被运送到脑部。
5.2 脑温 脑缺血模型往往存在脑低温保护现象，脑温每降低10℃，大脑代谢率可降低50％。因此在实验过程中须注意控制脑温。脑温相对于躯体独立存在，肛温不能真实反映脑温，须单独测量脑温[17]。
5.3 脑血流量 引起脑不可逆性损伤的脑血流量阈值是25 ml/（100 g.min）[18]。
5.4 血压 自发性高血压大鼠在MCA或双侧CCA夹闭后，脑血流量下降明显。缺血改变早，梗塞体积大[19]。
5.5 鼠种 同样制作Tamura模型，Wistar-Kyoto大鼠MCA闭塞平均脑梗塞体积最小，变异最大；Fischer-344大鼠梗塞灶最大，病变一致性好；Sprague－Dawley大鼠居于两者之间[19]。
总之，脑缺血动物模型种类很多，应根据实验目的选择合适的模型制作方法，并在实验中注意调控有关指标，对生理学、生物化学、形态学、动物神经行为学的监控手段，也应具有科学性和先进性，以避免产生错误的实验结果。
*国家自然科学基金(39570263)和广东省自然科学基金(950537)
作者单位：刘红梅,女,1971年出生,1998年毕业于第一军医大学,硕士,医师,助教,电话85142100
作者单位：刘红梅 高天明 (第一军医大学南方医院超声诊断科，广州，510515)
佟振清 (第一军医大学生理学教研室，广州，510515)
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