缺氧、缺血与迟发性神经元死亡
丁艳洁 蒋 犁综述 汤云珍审校
南京铁道医学院临床医学系儿科研究室（210009）
摘要 脑缺氧缺血（HIE）后的细胞损伤发生于两个阶段，即早期的组织梗死与晚期的迟发性神经元死亡。目前认为迟发性神经元死亡是通过凋亡途径发生的。本文介绍了迟发性神经元死亡的机制，凋亡与坏死的区别及脑缺氧、缺血后神经元凋亡的证据。
关键词 脑缺氧 脑缺血 脑损伤 吞噬作用
围产期窒息被认为是造成永久性神经损伤的重要原因之一。脑缺氧缺血（HIE）后的损伤，过去一真认为是由急性能量衰竭造成的细胞坏分子死导致的，包括神经元与胶质细胞的死亡。一般于缺血后一天内发生，三天时达到高峰[1]，但长期以来不能解释为什么在脑缺血复苏一段时间后，病情反而进一步加重。例如在新生儿产时窒息造成的短暂缺血缺氧（HI）损伤后，复苏后短时间内相对正常，而于数小时后出现迟发性脑损伤的表现[2]。
迟发性神经元死亡
动物实验发现，HI后的细胞死亡可发生在两个不同的阶段[1]。第一阶段在HI过程中，急性能量衰竭导致细胞外离子平衡失调，细胞内钠钙积聚，细胞水肿，严重者导致细胞破裂。此外，兴奋时氨基酸与自由基等因素可加重损伤。这一阶段的细胞死亡涉及神经元与胶质细胞。第二阶段的细胞死亡通常发生于数小时之后，仅涉及神经元，即选择性神经元损伤。因其发生的时间延后，称为迟发性神经元死亡[1，3]。尽管能量耗竭、离子失平衡等造成第一阶段细胞死亡原因同样可作用于第二阶段，但这些机制均不能很好解释为什么会有这种延迟现象。并且，动物实验发现HI后的细胞死亡方式决定于损伤的严重程度，短暂损伤后发生迟发性选择神经元死亡，通常发生于缺血敏区——海马CA1区神经元；而严重损伤迅速导致梗死，包括神经元与胶质细胞的死亡[1，4]。这些均提示HI后的损伤是通过两种不同的途径产生的，而迟发性神经元损伤的机制用传统的坏死的观点无法解释。
迟发性神经元死亡的机制——凋亡
为探讨迟发性神经的死亡的可能机制，进行了大量的实验研究，提出了一系列假说[5，7]，包括兴奋性氨基酸毒性，蛋白合成受抑，热休克蛋白表达受阻，脂肪酸与自由基（包括一氧化氮)，能量代谢与脑循环衰竭和线粒体DNA表达受阻等多种学说，但均未能很好地解释这一现象。近年来凋亡的新生儿脑内可观察到细胞凋亡的特征：核固缩、染色质聚集但胞膜完整。提示凋亡参与了短暂HI后的神经元损伤。
目前的研究证明，缺血后脑组织通过两种途径发生损伤；坏死（necrosis）与凋亡（apoptosis）。而迟发性神经元损伤的机制为凋亡[1，3，4，9，10]。
脑缺血的严重程度、持续时间决定了脑组织是通过坏死还是凋亡途径发生损伤[1，4]。成年鼠大脑中动脉结扎造成的局部缺血模型中，缺血90分钟产生梗死，其面积1天后达到最大，这一迅速发生的组织破坏主要是通过坏死造成的。缺血30分钟，1天内不能观察到梗死，但在第3天可观察到小梗死灶，第2周时，梗死灶面积与缺血90分钟所致者等大，这一迟发性损伤的机制是凋亡而不是坏死[4]。在未成年动物HI模型中也观察到同样两种损伤机制。
凋亡与坏死
凋亡是1972年由Kerr等人提出。凋亡在正常发育过程发挥作用，在生理情况下也称“程序性细胞死亡（PCD）”。近年来发现凋亡与某些病理状况有关，过度抑制或过度增强均可导致疾病。
凋亡是在某些弱或亚致死量刺激下，诱发细胞产生核酸内切酶，将DNA在核糖体间切割成180-200bp大小片段，电泳后显示“DNA梯带（DNA片段）”，而细胞器未受破坏。形态学上可见染色质固缩、边集，细胞质收缩。相当长一段时间内可见胞膜完整，而后形成细胞吞噬，即凋亡小体。整个过程为一主动过程，需能量，有时需mRNA与蛋白质合成，无炎症反应。
而坏死是在严重损伤下发生。能量衰竭后，细胞内外离子平衡无法维持，细胞肿胀，细胞器破坏，染色质随机降解，电泳显示“DNA拖影（DNA smear）”。最后膜破坏，内容物释出，引发炎症反应。其过程为被动非颠倒过程，不需能量[11]。
目前用于检测调亡的方法主要有4种：（1）凋亡形态学特点；（2）原位末端标记阳性；（3）电泳时呈现“DNA片段”；（4）流式细胞仪定量检测。
脑缺氧缺血后凋亡的证据
目前于成年[12，13]、未成年大鼠[1，9]、小鼠[10]、沙鼠[12]和新生猪[14]等多种动物HI模型上及细胞培养的HI模型[15]中均检测到凋亡的证据。
未成年大鼠（21天）HI模型中，温和性（15分钟）损伤后，用原位标记技术检测DNA片段[1]。于缺血后3天，在海马CA1-2锥体细胞，皮质3-5层细胞，纹状体神经元检测到DNA片段[1]。海马区DNA提取物电泳后显示DNA片段，长度为180bp左右，同时在这些区域可观察凋亡形态学改变。严重（60分钟）损伤后，24小时内发生广泛坏死。与选择性神经元损伤相比，其DNA为随机降解（24小时）。电泳显示DNA smear,直到3天后才可检出片段。
新生鼠（7天）在HI之后，用原位标记技术可在结扎侧皮质、海马、纹状体、丘脑检出DNA片段，并且延长缺氧的时间，标记阳性的细胞数目增加[9]。新生猪在HI之后发生迟发性神经元死亡，可检测到大量神经元凋亡，且程度与损伤的严重程度有关[14]。
其他动物模型中，均可在发生迟发性神经元损害的区域（尤其是海马CAI区），检测到DNA片段，电泳显示DNA片段，同时可观察到凋亡形态改变[3，10，12，13，15]。流式细胞仪检测显示缺血区皮质完整细胞中DNA降解，出现低于G0/G1期DNA含量的“亚G1”期细胞，形成Ap峰——凋亡峰。用蛋白合成抑制剂[13]（如放线菌酮）和N-甲基-D天冬氨酸（NMDA）受体拮抗剂[16]（如 felbamate）可减轻迟发性神经元损伤的程度。
并且，在HI损伤的动物模型之中，可以检测到一系列凋亡相关基因的表达（mRNA和/或蛋白质）如Fas家族[17]、ICE家族（白细胞介素-1β转化酶基因家族）[18]、bcl家族[19，20]、 fos及jun家族[20]。另外，Linnik 等人于鼠缺血性损伤前，用携带抗凋亡基因（bcl-2）的单纯疱疹病毒-1进行皮质内注射，结果显示注射部位的组织存活率较邻近组织明显升高[17]。而另一实验证明达表bcl-2的转基因小鼠局部缺血后梗死面积明显减小[18]，这些均提示凋亡参与了HIE后的细胞损伤。
总之，短暂HI后脑组织发生迟发性神经元死亡，而凋亡是其发生的可能抑制。进一步的研究明确了HIE与凋亡之间的关系，为今后新生儿HIE的治疗，特别是迟发性损伤的治疗开辟了新的途径。
参考文献
1.Beilharz EJ,Williams CE.Dragunow M,et al.Brain Res Mol Brain Res,1995;29(1):1-14
2. Azzopardin D,Wyatt JS,Cady EB,et al.Pediatr Res,1989;25(5):445-451
3.Nitatori T,Sato N,Waguri S,et al.J Neurosci,1995;15(2):1001-1011
4.Hu C,Hu R,Csernansky CA,et al. Cereb Blood Flow Metab,1996;16(2):195-201
5.Abe K,Aoki M,Kawagoe J,et al.Stroke,1995;26(8):1478-1489
6.Small DL,Buchan AM.J Cardiothorac Vasc Anesth,1996;10(1):139-146
7.Mehmet H,Edwards AD.Arch Dis Child,1996;75(2):F73-75
8.Yue X,Mehmet H,Squier MV,et al.Pediatr Res,1995;37(3):387A
9.Hill IE,Macmanus JP,Rasquinha I,et al.Brain Res,1995;676(2):398-403
10.Guegan C,Boutin H,Boudry C,et al.C R Acad Sci Ⅲ，1996；319（10）：879-885
11.Akins PT,Liu PK,Hsu CY.Stroke,1996;27(9):1682-1687
12.Li Y,Chopp M,Jiang N,et al.Brain Res Mol Brain Res,1995;28(1):164-168
13.Matthew D,Linnik MD,Zobrist RH,et al.Stroke,1993;24(12):2002-2009
14.Mechmet H,Yue X,Squier MV,et al.Neurosci Lett,1994;181(1/2):121-125
15.Rosenbaum DM,Michaelson M,Batter DK,et al.Ann Neural,1996;36:864-870
16.Wasterlain CG,Adams LM,Wichmann JK,et al.Stroke,1996;27(7):1236-1240
17.Kiessling M,Gass P.Brain Pathol,1994;4(1):77-83
18.Bhat RV,Dirocco R,Marcy VR,et al. J Neurosci,1996;16(13):4116-4154
19.Gillardon F,Lenz C,Waschke KF,et al.Brain Res Mol Brain Res ,1996;40(2):254-260
20.Asahi M,Hoshimaru M,Uermura Y,et al.J Cereb Blood Flow Metab,1997;17(1):11-18
