中枢神经系统创伤体外模型研究进展
第一军医大学南方医院神经外科(510515) 王克万（综述）
第三军医大学野战外科研究所(400042) 杨志焕 王正国（审校）
摘 要 中枢神经系统创伤体外模型因其能够精确控制细胞外环境，观察创伤后某种特定细胞的病理生理变化，实时监测损伤时细胞生物力学参数的改变，在近年来倍受重视。本文就目前体外创伤模型的种类及有关研究进展进行综述。
关键词：创伤 继发性脑损伤 细胞培养 损伤模型
中枢神经系统(CNS)创伤体外模型能消除在体时缺血和炎症等各种复杂因素的影响，观察某种特定细胞的病理生理变化，实时监测损伤时细胞生物力学参数的改变，提供一些在体研究不能得到的信息，因此近年来倍受关注。
1 CNS体外创伤模型的种类、生物力学机制和评价
近年来基于CNS创伤性损伤机制，已经开发了许多模型用于研究离断、挤压、加速、牵张和剪应力的作用。
1.1 离断损伤体外模型
轴索离断是弥漫性轴索损伤和脊髓横断伤的重要病理表现。为此研究者建立了两种体外离断损伤模型。
Gross等(1983)首先用激光进行单细胞突起离断，可在距细胞体特定范围内切断某一突起或数个突起。这种模型可提供精确的参数，可用作脊髓横断损伤的体外研究模型。另外一种离断损伤模型是培养细胞机械划痕损伤。Tecoma（1989）首次采用这种模型研究神经元体外创伤性损伤。Muhkin等[1]改进了这种模型，他们用电动的转子进行划痕损伤，由转子上的针头数量来控制损伤的程度和范围，具有致伤条件统一，更简便快捷的特点。这种模型操作简单，费用较低。也是唯一可用来研究继发性脑损伤级联反应的体外模型。离断性损伤的缺点是不能获得力学参数，如应变力的大小及应变率等。
1.2 压迫损伤体外模型
压迫性损伤在脊髓损伤中十分常见，为了在体外模拟压迫创伤，Ballentine(1988)用自由落体损伤体外培养的脊髓片来复制脊髓的压迫性损伤。这种模型不能测量撞击的应变力和应变率，得不到组织损伤的生物力学参数。
另一种是气压和液压损伤模型，可以精确地测定生物力学参数。Shepard(1991)用20ms以下6atm的短暂压力作用于一个密闭的充满液体的装置，使放入装置内的培养细胞损伤。Wallis(1995)等用1kg的重锤从61cm高落体作用于密封的充满液体的小室，使小室内的细胞受到传递的压力损伤。Murphy(1993)使培养细胞承受15atm、10分钟，使细胞产生损伤。然而在体损伤承受的压力远比体外实验的压力低，长时间持续压力也与临床脊髓损伤机制相差甚远。同时由于损伤装置的不可压缩性，与在体损伤的发生机制明显不同。因此，此类模型未得到广泛的推广应用。
1.3 加速损伤模型
闭合性颅脑损伤主要是由于头颅的加速和减速运动产生的脑内负载在脑实质中形成剪应变所致。
Lucas(1991)用撞击振动产生200g加速度作用于培养细胞，由切应力造成细胞损害。这种模型的缺点是细胞对加速的反应变化不能测定。Laplaca[2]改进了此模型。这个装置由两块平行的粘度计板组成，细胞生长在其中的一块板上，这两块板浸入培养基中，使其旋转产生的水动力使细胞致伤，力的大小由旋转速度和两板间距离控制。致伤时可在显微镜下由高速摄影观察细胞的变化。通过应用粘附的微珠，能够计算单个细胞承受的应力。但这种流体压力的改变与在体创伤的相关性目前尚不清楚。
1.4 牵张损伤模型
根据生物力学研究得到的颅脑创伤发生时的力学参数，近年开发了培养细胞牵张损伤装置，这种模型已引起广泛的关注。
Ellis[3]等用6孔硅胶膜培养皿，给予一定的正压使硅胶膜牵张变形，导致培养于硅胶膜上的细胞牵张损伤。Cargill等[4]用自制的薄硅胶膜培养皿用真空负压冲动使之变形也可使细胞损伤。此模型的优点是致伤条件易控制，重复性好，可以测量应变率，可用不同的应变率损伤细胞。这种精确的控制有利于比较细胞对生理或损伤变形的反应，对阐明创伤性脑损伤机制有一定作用。由Morrison[5]报道的改进装置用激光位移转换器直接测量牵张过程中膜的位移，用计算机控制的电磁阀控制损伤时间和波形。国内同期研制的多功能小型生物撞击机亦具备这种优势，其计算机控制的电磁阀可精确控制损伤时间和程度。
因为在脑组织创伤性损伤过程中，组织承受的力是应变和切变的综合作用，牵张损伤模型具备了这个特性，细胞在受到驱动压力牵张变形过程中不仅有牵张的应力，而且还承受切变的应力。
2 用于体外创伤研究的细胞类型
2.1 组织培养
组织培养是CNS的组织片或组织块体外直接培养，细胞可维持体内结构的空间排列状态。可以研究细胞间相互作用、基于细胞三维结构的电生理特性及细胞外信号分子的分布。但其制备技术较为复杂。细胞损伤的实时观测及细胞应变的测定受脑片厚薄的影响。
2.2 细胞培养
原代培养细胞：由于星形胶质细胞在体外可以分裂，易于纯化，使其成为目前体外损伤研究最常用的原代培养细胞之一[3]。由于神经元是终末分化细胞，分离纯化十分困难，故目前的培养神经元体外损伤研究多是神经元和胶质细胞混合培养[6]。原代细胞培养的优点是可以对某种特定细胞及细胞间的相互作用进行研究。但体外培养细胞目前仍只能用胎鼠或新生鼠进行，在分离过程中可能造成细胞损伤。
细胞系：细胞系对生长条件要求较低，易于培养，可以冻存和无限传代。细胞系持续分化的特性表明它们的基因表型和蛋白表达已与正常的细胞显著不同，因此对于结果的解释应持慎重态度。
3 损伤程度的评估方法
3.1 形态学检查
细胞损伤后在相差显微镜下可实时观察细胞损伤的早期变化。在体外损伤中，细胞呈现和在体损伤类似的病理形态学改变[3]。用扫描电镜可以观察到细胞突起和胞体的断裂。细胞体外损伤后早期超微结构即发生明显改变[3]。
3.2 损伤细胞的检测
体外细胞损伤和死亡检测最简便的方法是染料拒染法，常用台盼蓝(trypan blue)，此法简便易行[1,6]。Muhkin[1]用酶标仪定量检测台盼蓝的量，使这一方法得以进一步改进。
另外荧光染料碘化丙啶(PI)常被用于鉴定死亡的细胞，但Eliis认为PI可以鉴别损伤的细胞，只要细胞膜完整性破坏，都可以着色，当细胞修复后则又拒染[3]。
鉴定细胞损伤通透性增高的最常用的生化方法为培养上清中乳酸脱氢酶(LDH)的测定。LDH测定方法简便，结果稳定。研究发现LDH结果与台盼蓝结果非常一致，具有显著相关性[6,7]。
3.3 末受损伤细胞的检测
MTT(噻唑蓝)可透过活细胞质膜被氧化成蓝紫色结晶，此产物在一定范围内与细胞数成正比，可用比色法测定活细胞的数量。
微管相关蛋白2(MAP-2)是特异性分布于神经元的胞浆和突起中的细胞骨架蛋白，神经元损伤时免疫组化染色可见MAP-2减少或消失，MAP-2可以反应神经元损伤的程度[8～9]。是目前鉴别神经元损伤的特异性方法。
3.4 凋亡细胞的检测
体外培养神经元损伤也同样有凋亡现象[10]。凋亡细胞的检测方法主要有形态学检查、DNA片段凝胶电泳、原位TUNEL标记、流式细胞仪检测等。
3.5 细胞功能变化的检测
在细胞损伤早期，细胞功能改变可由核转录因子c-fos，c-jun，NF-κB等特征性向核内转位和表达的变化观测。作者利用核转录因子这一特点，简便地证明了创伤性损伤混合培养大鼠皮层神经元后，培养基内可释放出神经毒性物质。
4 体外损伤模型在创伤性脑损伤研究中的应用
4.1 研究体外创伤后细胞内离子失衡和细胞电生理特性的改变
Rzigalinski[11]等人的研究表明体外损伤后90分钟，星形细胞内钙的含量就达对照组的2～3倍。研究中发现，低钙可以保护神经元，但却增加星形细胞的质膜损伤，而且增加钙离子进入细胞的药物A23187，可以保护星形细胞。作者认为这可能是不同的细胞对损伤的反应不同。在其随后的研究中发现，创伤性牵张损伤引起的钙离子升高在损伤后3小时到24小时之间恢复正常，但损伤可导致钙介导的信号转导产生持续性变化，并认为创伤性脑损伤的病理变化过程，钙离子介导的信号通路改变可能起重要作用，而不是单纯的钙离子增高[12]。
培养神经元牵张损伤后与NMDA受体相关的电压依赖Mg2+的阻断可以减少NMDA受体活化产生的大离子电流和细胞内Ca2+增高[13]。脑片培养的体外损伤模型可以复制脑损伤后早期时相点的电生理特性。
4.2 研究体外创伤后生化和细胞因子的改变
Lamb[14]研究表明，牵张损伤星形细胞后卵磷脂合成增加，和脂代谢有关的酶诸如磷脂酶A2(PLA2)、磷脂酶C(PLC)等酶也升高。体外损伤模型还可以附加缺氧、细胞因子等复合因素的作用，可以更深入地了解创伤的机制。Malhotra[15]等用划痕或/并化学损伤9L神经胶质瘤细胞系，导致细胞肥大，胶质纤维酸性蛋白和J1-31抗原免疫组化反应增强，两种损伤因素具有协同作用。表明星形细胞的活化可能与不同的转录机制有关。由于没有小胶质细胞、神经元和少突胶质细胞的相互作用，以及分离培养时的损伤因素，因而比原代星形细胞培养具有某些优点。
4.3 神经保护药物及机制的研究
体外创伤模型另一重要应用是筛选各种神经保护药物，寻找新的治疗手段。研究表明，NMDA受体拮抗剂MK801和电压依赖钙通道阻滞剂尼莫地平、尼法地平联合应用对损伤的神经元保护具有协同作用[6]。NO合酶的抑制剂甲基-L-精氨酸对创伤所致的急性分离海马脑片的损伤具有保护作用[16]。白三烯代谢抑制剂对液体叩击压力致伤的体外培养海马脑片具有保护作用，可以恢复海马的顺行和逆行的反应[17]。
亚低温对创伤的保护机制研究在体外容易进行，因为在体外可以精确控制细胞外环境的温度。
4.4 体外创伤分子生物学研究
体外创伤模型的分子生物学研究刚刚起步，研究报道甚少。它不仅可以用来研究创伤发生分子生物学机制，而且是研究创伤基因治疗最好的模型之一。Lefrancois等[18]用反义技术抑制星形细胞GFAP的表达，研究对神经元突起离断损伤后神经元突起再生的影响，结果显示在反义GFAP转染的培养细胞中，在损伤后72小时进入损伤区突起的数目和长度明显高于末转染的细胞。由于没有在体环境的复杂性如炎症、坏死等情况的干扰，在体外转染比体内更有效。因此体外创伤模型是筛选新的基因治疗措施非常有价值的工具。
参考文献
1 Muhkin AG,et al.J Neurotrauma,1997;14:651
2 Laplaca MC,et al.J Neurotrauma,1997;14:335
3 Ellis EF,et al.J Neurotrauma,1995;12:325
4 Cargill RS,et al.J Neurotrauma,1996;13:396
5 Morrison Ⅲ B,et al.Ann Biomed Eng,1998;26:381
6 Regan RF,et al.Brain Res,1994;633:236
7 Koh JY,et al.J Neurosci Methods,1987;20:83
8 Posmantur RM,et al.J Neurotrauma,1996;13:125
9 Ballough GpH,et al.J Neuroscience Methods,1995;61:23
10 Copin JC,et al.J Neurotrauma,1996;13:233
11 Rzigalinski BA,et al.J Neurochem,1997;68:289
12 Rzigalinski BA,et al.J Neurochem.1998;70:2377
13 Zhang L,et al.Science,1996;274:1921
14 Lamb RG,et al.J Neurochem,1997;14:335
15 Malhotra SK,et al.Cytobios.1997;89:115
16 Wallis RA,et al.Brain Res,1996;710:169
17 Girard J,et al.Eur J Pharmacol,1996;300:43
18 Lefrancois T,et al.J Neurosci,1997;17:4121
