李鸿钧；马雁冰（综述）；孙茂盛（审校）
中国医学科学院/中国协和医科大学；医学生物学研究所；昆明650118
摘要：胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）、neurturin(NTN)、persephin(PSP)、artemin(ART)共同构成TGF-β超家族的一个亚家族。四者结构相似、功能相关，且氨基酸顺序有较高的同源性。在体内，它们都是以前体的形式分泌，经加工、修饰，成熟的蛋白质分子为二硫键连接形成的同源二聚体。对中脑多巴胺能神经元、颈上神经节交感神经元、脊髓运动神经元等具有明显的营养与保护作用。在信号传导中，GDNF家族α受体（GDNF Family Recepter alpha,GFRα)与原癌基因c-ret编码的产物蛋白Ret共同形成GDNF家族成员的功能性复合受体，介导GDNF家族成员的生理功能。
神经营养因子对于神经系统的发育及营养具有重要意义，并能促进神经元细胞的存活及预防由于损伤、毒素及病理性改变所导致的神经元细胞退行性病变。胶质细胞源性神经营养因子（glial cell line-derived neurotrphic factor,GDNF）、neurturin(NTN)、persephin(PSP)、artemin(ART)是一类结构相似、功能相关的分泌型蛋白质，其一级结构都具有七个保守的、相对位置相同的半胱氨酸残基，并具有相似的空间结构，核苷酸序列、氨基酸顺序也具有较高的同源性。它们是转化生长因子β（transforming growth factor beta,TGF-β）超家族的远亲，共同构成TGF-β超家族的一个亚家族。另外，这一家族神经营养因子在生理功能、受体、信号传导途径等方面都具有相似性。目前已对这类细胞因子在基因克隆和定位、蛋白分子特点、mRNA分布、生理功能、受体和信号传导途径等诸多方面进行了研究。本文就以上这几个方面对GDNF家族神经营养因子的研究进展作一综述。
1、GDNF家族神经营养因子的结构特点
1.1基本性质及分子结构
GDNF是1993年发现的蛋白质因子，它最选 是由Lin等从大鼠胶质细胞系B49的无血清培养基中经浓缩、分离纯化出来的，能激活体外培养的鼠胚腹侧中脑多巴胺能神经元摄取多巴胺，促进神经元存活。他们利用来源于B49细胞的多聚腺苷（polyA）RNA，建立cDNA文库，经筛选获得大鼠的GDNF cDNA。在此基础上克隆到人的GDNF基因，序列分析发现GDNF基因全长700bp，编码211个氨基酸前体蛋白，前19个氨基酸为信号肽，经加工修饰成熟的GDNF含有134个氨基酸，以二硫键连接成同源二聚体，含有7个保守的半胱氨酸残基，这些半胱近残基所处的空间位置与所有TGF-β超家族成员相同。
1996年Kotzbauer等在筛选体外培养的重组生长因子表达细胞系时，从中国仓鼠卵巢细胞的条件培养基中发现了一种具有促进神经元存活的物质，经分离、纯化得到一种分子量为25KD的新的纯化蛋白，称为Neurturin(NTN)，随后他们克隆到了小鼠及人的NTN基因，人NTN基因（hNTN）cDNA包含一个开放阅读框架（open reading frame，ORF），编码197个氨基酸组成的前体 蛋白，该蛋白N端19个氨基酸为信号肽，其后为前体区，经蛋白酶切割后，成熟NTN蛋白由102年氨基酸组成，通过二硫键形成同源二聚体，氨基酸顺序与GDNF有42%的同源性。hNTN基因含有两个外显子，一个内含子，定位于人染色体19p13.3区。
继GDNF、NTN被成功发现之后，人们试图寻找GDNF家族的其它成员，由于该家族成员之间核甘酸序列的高度同源性，Milbrandt等针对GDNF和NTN的高度同源区设计了简并引物，经过RT-PCR克隆到了小嫌的PSP基因（mPSP）、mPSP cDNA编码156个的前体蛋白，N端为信号肽，其后为前体区，成熟PSP蛋白由96个氨基酸构成。随后他们利用简并PCR方法及人cDNA文库筛选，克隆到人PSP基因（hPSP），hPSP含有两个外显子，一个内含子，编码156个氨基酸的前前体蛋白，氨基酸顺序与GDNF和NTN有40%的同源。一级结构也具有7个保守的半胱氨酸。
GDNF家族第四个成员Artemin(ART)是1998年12月由Robert等发现的。他们以成熟NTN蛋白顺序为标准，通过高含量基因组顺序（high throughput genome sequences,HTGS）数据库发现两个细菌人工染色体（bacterial artificial chromosome,BAC）克隆含有与GDNF、NTN及PSP相似蛤不相同的同源开放读框（homologous open reading frame，hORF），表达序列标签（homologous tag,EST）数据库表明该hORF为一种表达基因，用PCR方法也扩增到了跟该hORF相关的鼠基因组DNA，并利用cDNA末端的随机扩增（random amplification of cDNA ends,RACE）技术从人及鼠的组织cDNA文库扩增到了全长的cDNA顺序，经分析全长cDNA，表明hORF编码的是一种新GDNF家族成员，即Artemin(ART)。ART全基因组有3个外显子，两上内含子，定位约45%同源，与GDNF同源怀约36%，ART蛋白一级结构与GDNF、NTN、PSP相似，具相对位置相同的7个保守的半胱氨酸残基，全长ART蛋白也是由信号肽、前体区及成熟蛋白三部分组成，成熟蛋白含有113个氨基酸。
1.2mRNA分布
GDNF mRNA在体内分布广泛，经RT-PCR检测，成年和发育中的大鼠，其纹状体、皮层、小脑、海马和脊髓中都有GDNF存在；在成人的纹状体、皮层、海马和脊髓中也检测到GDNF mRNA；另外，新生大鼠中枢神经系统以外的组织如肾、肺、心、脾、肝、血液、坐骨神经、睾丸、卵巢、皮肤、骨骼肌、肾上腺都有GDNF mRNA表达。NTN与GDNF类似，在体内mRNA也广泛存在。原位杂交显示，发育期及成年小鼠的大脑皮层、纹状体、脑干、垂体等部位都有NTN表达，便GDNF表达水平较高的脊髓未检测到NTN mRNA，另外，在非神经系统如心脏、血液、肺、视网膜、嗅粘膜、输尿管、卵巢和肠道平滑肌等部位NTN表达水平也较高。GDNF和NTN在体内广泛分布，提示它们对于神经系统和非神经组织的发育及生理功能的维持具有重要意义。
而PSP与GDNF、NTN不同，经RT-PCR发现，在成年及胚胎大鼠在部分组织中PSP表达量都很低，原位杂交法也未检测到mRNA存在。ART的mRNA分布介于GDNF、NTN与PSP之间。体外试验表明，成人外周组织中垂体、胎盘、气管高水平表达，在胎儿中，只有肾、肺高水平表达；成人及胎儿脑组织，包括基本神经节（下丘脑核、豆状核、黑质）及丘脑表达水平都很低，提示ART可能作用于皮层下运动系统；脊髓及背根本神经表达量也低，进一步经过第14天的大鼠胚胎（E14）研究表明，在神经根（不包括背根神经节）及肠系动脉周围表达，提示ART对于外周神经系统的作用可能有两种方法：对于背根神经节发育中的神经元以旁分泌方式起作用；对肠系膜上动脉等自主神经支配组织起到靶源性因子的作用。
2、GDNF家族神经营养因子的生理功能
2.1对多巴胺能神经元的作用 GDNF、NTN、PSP均能促进体外培养的大鼠胚胎中脑多巴受能神经元的存活，并促进对多巴胺高亲和力摄取。虽然在大鼠胚胎中脑膜侧未检测到ART表达，但经体外培养的多巴能神经元试验表明，ART也能促进多巴受能神经元的存活。离体实验表明，GDNF、NTN、PSP及ART四种因子对胚胎中脑多巴胺能神经元的促进存省作用功效相当。同时GDNF还能促进多巴胺能神经元形态分化，使神经元胞体增大、轴突延长。在黑质一纹状体系统中，GDNF与NTN均能促进多巴胺神经元的存活，但二者的生理功能仍有区别，Akerud等的研究表明，在出生后的个体发育过程中，NTN 在腹侧中脑表达逐渐下降而在纹状体中表达增加，而GDNF的表达正好与之相反；体、内外实验进一步研究表明，NTN只具选择性地促进多巴胺神经元存活效应，而GDNF除广泛的促进存活效应外，还能促进神经元轴突纤维的生长。
另一方面，GDNF家族神经营养因子还能预防体内多巴胺能神经元的退行性病变，经大鼠试验研究表明：大鼠纹体状体内注射6羟基多巴胺（6-OHDA）造成黑质及纹状体内多巴胺能神经元退行性病变，如果预先向大鼠黑质内注射GDNF、NTN或PSP，均可对抗6-OHDA造成的损伤，阻止多巴胺能神经元的死亡。可能是GDNF等作用于多巴胺能神经元的上受体GFRα1和GFRα2，通过一系列信号转导机制，刺激立及早期基因编码产生有生物活性的因子，起到稳定细胞内Ca2+等作用，从而阻止6-OHDA引起的多巴胺能神经元的损伤，这些结果表明：GDNF家族神经营养因子在体内能预防多巴胺能神经元的退行性病变，这一点对于治疗多巴胺代谢紊乱性疾病如帕金森氏病等方面，具有重要的临床意义。
2.2对外周神经系统的作用 GDNF、NTN、ART在体外均能促进多种发育中的外周神经元包括交感神经元、副交感神经元及感觉神经元的存活。首先，对颈上神经节交感神经元具有营养与支持作用；其次，也能促进多种神经元如背根神经节、三叉神经节感觉神经元存活，在这两群感觉神经元中，ART促进存活的神经元数量比GDNF、NTN多；另外，对鼻根神经节、内脏感觉神经元三者的促进存活能力相当。而PSP对于外周神经系统不起作用。
2.3对运动的作用 GDNF、NTN、PSPS能促进运动多巴胺的存活。通过腰段脊髓切面乳剂放射自显影技术显示，NF到神经元胞体；坐骨经济注射逆向转运研究也表明，在体内GDNF、NTN、PSPS能被逆赂运输到脊髓运动神经元胞体。以上这些结果说明，GDNF家族成员对运动神经元具有作用。以上些结果说明，GDNF家族成员对运动神经元具有作用。另一方面，也有研究表明DNF、NTN、PSPS能阻止体内运动神经元退行性病变，对脊髓运动神经元起保护作用。
3、GDNF家族的信号传导
GDNF家族神经营养因子信号是通过复合受体途径实现的，复合受体由两部分组成，第一部分是糖基化的磷脂酰肌醇（glycosyl-phosphatidyl inositol，GPI）锚定到细胞表面的蛋白分子，称为GDNF家族受体α（GDNF Family Recepter alpha，GFRα）；另一部分为原癌基因c-ret编码的产物蛋白Ret，它是一种受体酪氨酸激酶。前者特异性地结合GDNF家族成员，促使Ret磷酸化，磷酸化的Ret激活其下游的丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）等，导致一系列胞内途径的激活，从而发挥GDNF家族神经营养因子的生理功能。
3.1GDNF家族受体α（GFRα） 目前的研究表明GFRα至少有四种，即GFRα1、GFRα2、GFRα3、GFRα4、GFRα是与GDNF家族神经营养因子结合的部分，并且其结合能力是特异的、可逆的，用特异水解GPI连接位点的磷酯酰肌醇磷酯酶C（phosphoinositide-specific phospholipase C，PIPLC）处理培养的大鼠胚胎运动神经元或培养的神经细胞如NBL-S，则GDNF、NTN、ART的营养作用即被阻断。利用可溶性的Fc融合受体GFRα1～GFRα3研究发现，GFRα1-Fc能与GDNF、NTN结合，且二者亲和力相当，但不能一PSP、ART结合；GFRα2-Fc结合NTN，不结合GDNF ART；GFRα3-Fc仅与ART结合，而不结合GDNF家族其他任何成员。上述结果表明GFRα是GDNF家族复合受体的α亚基，其作用主要是参与GDNF家族神经营养因子的结合，不同的因子与不同的受体结合，其亲和力不同。GDNF主要结合GFRα1，NTN主要结合GFRα2，同时GDNF、NTN与受体的结合有部分交叉，GFRα3仅能与ART结合，ART也可以与GFRα1少量结合，PSP只能结合GFRα4，与其他三者无交叉。
3.2Ret-复合受体的信号传导成分 原癌基因c-ret编码的产物Ret蛋白是一种受体酪氨酸激酶，它与GFRα共同构成GNDF家族神经营养因子的功能性复合受体。由于GFRα是GPI连接的胞外蛋白，缺乏跨膜区及膜内区，单独无法信号传导。神经营养因子与GFRα特异结合之后，尚需一种跨膜蛋白的介导，信号才能进一步传入细胞内，这种跨膜蛋白即Ret蛋白，它与GFRα协同作用，共同参与GDNF家族营养因子的信号传导。Ret mRNA和蛋白在中枢、外周神经系统及肾脏高表达，ret基因的突变与人类的某些遗传病有关，如家族性的肾上腺甲状腺瘤、多发性的内分泌腺瘤2A型、2B型及先天性巨吉肠症。ret基因敲除小鼠实验导致一系列严重表型缺陷，包括肾发育不全、完全缺失肠道神经组织，这些缺陷与GDNF缺失突变引起的缺陷相似，提示Ret与GDNF功能的发挥相关。
成纤维细胞株NGF-38能表达Ret与GFRα，用PIPLC处理NGR-38细胞后，GDNF不能与之结合及诱导Ret磷酸化，但在介质中加入可溶性的GFRα1后，这些功能恢复；同样能表达Ret的TGW-I-nu细胞系与NTN作用后，Ret酪氨酸磷酸化水平升高，用PIPLC处理，则NTN作用后Ret磷酸化水平明显下降，加入可溶性的GFRα2后，又明显升高；在NBLS细胞系中，利用ART实验也得到同样的结果。可见GFRα与Ret对于DDNF家族神经营养因子信号转导都是必不可少的，免疫沉淀及Western Blot进一步表明，GFRα与Ret在细胞表面形成一个功能性的受体复合物，前者特异性的结合GDNF家族成员，后者进行跨膜信息转导。现在已经知道GDNF家族神经营养因子结合GFRα后，导致Ret酪氨酸激酶磷酸化，磷酸化的Ret引起下游激酶：MAPK、PI-3激酶（phosphati-dylinositol 3-kinase,PI-3）等的激活，从而将信息传递到细胞内，发挥GDNF家族成员的生理功能。
综上所述，胶南细胞源性神经营养因子家族成员GDNF、NTN、PSPS和ART多种神经元，如中脑多巴胺能神经元、颈上神经节交感神经元、脊髓运动神经元等具有明显的营养与保护作用。这对于神经系统疾病，如帕金森氏病、脊髓侧索硬化症等的治疗可能具有一定疗效。另外GDNF家族对于非神经GFRα和Ret共同形成GDNF家族成员的功能性复合受体，介导GDNF家族成员的生理功能。随着人类基因组计划的研究进展，遗传信息数据的不断丰富，神经营养因子家族的其他成员还将被发现，这将有助于人们加快对神经元起营养及保护作用的潜在的影响因素的认识，从而为神经系统疾病的基因治疗及药物开发奠定基础。
国外医学临床生物化学与检验学分册 2002年第2期第23卷
