RNA干扰技术及其在神经科学研究中的应用
王汉森，张玉稚，潘虹，吴希如
（北京大学第一医院儿科，北京 100034）
[摘 要] RNA干扰(RNAi)是指生物体内由双链RNA介导同源序列mRNA的特异性降解, 从而导致基因沉默的现象。近年来，随着对RNAi研究的不断深入，其作用机制正在逐步被阐明；同时作为阻断基因表达的新手段，RNAi技术也日趋完善和成熟。以其高效性和特异性, RNAi为反向遗传学在神经科学研究中的应用提供了有力的工具。本文仅就RNAi技术的有关研究进展及其在神经科学研究中的应用作一概述。
[关键词] RNA干扰；神经元；基因功能；反向遗传学
RNAi technique and its application to neurscience research
WANG Han-sen, ZHANG Yu-zhi, PAN Hong, WU Xi-ru
(Department of Pediatrics, Peking University First Hospital, Beijing 100034, China)
[Abstract] RNA interference (RNAi) is a way by which double-stranded RNA degrades its homological mRNA and leads to gene silencing in cells. With the further studies of RNAi in the last few years, more about its mechanisms has been elucidated. Moreover, as a technique to inhibit gene expression, RNAi is becoming more and more perfect in the studies of functional genomics. It also provides a powerful tool for reverse genetics in neurscience research. The recent advancement in RNAi technique and its application in neuroscience research were concisely reviewed in this paper.
[Key words] RNA interference; neuron; gene function; reverse genetics
RNA干扰（RNA interference, RNAi）是指在多种生物细胞内，由双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）介导同源序列mRNA的特异性降解，从而导致基因沉默（gene silencing）的现象。因RNAi所致的基因沉默发生在转录后水平，所以被称为转录后基因沉默（post-transcriptional gene silencing, PTGS）[1,2]。RNAi现象广泛存在于大多数真核生物中，这种存在揭示了RNAi很可能是出现于生命进化的早期阶段。近年来，随着对RNAi研究的不断深入，其作用机制正在逐步被阐明；同时作为阻断基因表达的新手段，RNAi技术也日趋完善和成熟。RNAi为反向遗传学( reverse genetics )在神经科学研究中的应用提供了有力的工具，其作用越来越为人们所重视。
1 RNAi的研究进展
1.1 RNAi 的分子机制 细胞中dsRNA的存在是RNAi形成的先决条件。dsRNA可通过多种途径在细胞核或胞质中产生。如反向DNA重复序列的转录；同时合成正义和反义RNA链；病毒复制；以单链RNA（single-stranded RNA, ssRNA）为模板在RNA依赖性RNA聚合酶 ( RNA-dependent RNA polymerase, RdRP ) 的催化作用下，合成互补RNA序列，并与之形成dsRNA。在线虫（C. elegans）可通过注射dsRNA、将线虫浸泡在含dsRNA的溶液或喂哺表达正义和反义RNA的细菌等方式引入dsRNA[3]。小干扰RNA(small interference RNA, siRNA)是RNAi过程中重要的中间分子。siRNA是一类长约21~23个核苷酸（nt ）的特殊dsRNA分子，与所作用的靶mRNA序列具有同源性，每一条链的均有2个nt 3’突出端(end overhangs)。 RNAi主要是通过dsRNA被核酸酶切割成21～23nt的siRNA, 再由siRNA介导识别并靶向切割同源性靶mRNA分子而实现[2, 4]。
通过对RNAi所进行的遗传学与生物化学的研究，现已初步阐明了其作用机制。RNAi的第一步是，dsRNA在核酸内切酶（一种具有RNaseⅢ样活性的核酸酶）作用下，被加工裂解为21～23nt的由正义和反义序列组成的siRNA。在果蝇（Drosophila）中RNaseⅢ型核酸酶称为Dicer，具有解旋酶（helicase）活性、dsRNA结合区以及PAZ结构区。在线虫、哺乳动物均存在Dicer同类物[1, 4]。RNAi的第二步是，由Dicer产生的siRNA的反义链指导形成一种核酸内切酶复合体，称为RNA诱导的沉默复合体（RNA-induced silencing complex, RISC）。RISC介导切割靶mRNA分子中与siRNA反义链互补区域的中间位置，使mRNA降解，从而干扰基因表达。siRNA还可以作为一种特殊的引物，在RdRP的作用下，以靶mRNA为模板合成dsRNA分子，后者又可被RISC降解为新的siRNA，新生成的siRNA又进入上述循环，这一过程被称为随机降解性聚合酶链反应（random degradative PCR）[5]。新生的dsRNA反复合成与降解，不断形成新的siRNA，从而使靶mRNA渐进性减少，导致目的基因沉默，呈现RNAi现象。RdRP一般只对所表达的靶mRNA发挥作用，这种在RNAi过程中对靶mRNA的特异性扩增作用，有助于增强RNAi的特异性基因监视作用。每个细胞仅需少量dsRNA即有可能完全抑制相应基因表达，可见RNAi具有生物催化反应的基本动力学特征[ 6, 7 ]。
1.2 RNAi的特征 从RNAi的作用机制，可以看出RNAi具有以下显著特征[ 1, 2, 8 ]：⑴RNAi是dsRNA介导的PTGS机制。在此过程中，启动子是活跃的，基因可以进行正常转录，但不能正常积累mRNA, 从而使基因在转录后水平失活。⑵高特异性。RNAi只降解同源mRNA，而其他mRNA的表达则不受影响；siRNA除正义链3’端两个碱基在序列识别中不起重要作用外，其他单个碱基的改变，就有可能导致RNAi的失败。⑶高效性。siRNA能在低于反义核酸几个数量级的浓度下，显著抑制基因表达甚至完全敲除，从而产生缺失突变体表型，比基因敲除更快更简单，而且对于那些在胚胎中敲除后致死的基因，也可利用RNAi技术进行研究。此外， RNAi具有强大的细胞穿透力，可在细胞间传递和维持，在线虫中干扰效应甚至可以传递到后代中去。
1.3 RNAi技术的形成与发展 RNAi作用能够高特异和高效率地抑制生物体某一基因的表达，使其不能发挥作用，为应用反向遗传学研究基因功能提供了一种快速和简便的方法。随着RNAi原理在基因功能研究中的应用，RNAi技术便应运而生并得到了迅速发展。
RNAi作为反向遗传学研究的工具运用于不同的生物体时，通常所采取的具体方法也有所不同，这主要是因为dsRNA的导入所要求的技术条件不同引起的。早期的RNAi技术首先在线虫和果蝇等低等的动物中得到应用。dsRNA可通过直接注射入性腺、将虫体浸泡入含dsRNA的溶液以及喂哺携带可表达两条互补ssRNA或发卡状RNA（hairpin RNA, hp RNA）的质粒的细菌等3种方式导入线虫。通过对线虫直接注射dsRNA的方法，现已明确了许多基因的功能。将dsRNA直接注射果蝇胚胎的方法，已在与发育有关的基因功能研究得到了应用；应用载体表达反向重复发卡状结构的策略，可以在成年果蝇中实现稳定的基因沉默。但dsRNA诱导RNAi在哺乳动物体细胞的应用却受到阻碍，原因在于dsRNA可通过激活dsRNA依赖性蛋白激酶和干扰素途径，导致蛋白合成广泛抑制，以及诱导2’，5’-多聚腺嘌呤酸合成，激活非特异性的Rnase（Rnase L），从而产生对脊椎动物细胞基因表达的非特异性效应[ 9 ]。
小于30 个nt的dsRNA即siRNA，已被证明不会造成上述非特异性反应。许多研究者已将其应用于哺乳动物细胞，并成功地造成对基因表达的序列特异性抑制。所采用的siRNA长度一般为21~23 nt，由化学合成或T 7 RNA聚合酶体外转录的正义与反义RNA单链退火而获得，并具有2个nt 3’突出端。siRNA具有较高的稳定性，以3 ’端突出TT的siRNA尤为稳定，由脂质体介导转染细胞。siRNA介导RNAi的效能，取决于siRNA的有效性、转染效率、细胞类型以及目的蛋白更新速度等多种因素[ 2, 10,11 ]。
由于有些类型细胞脂质体转染效果差，转移到细胞内的siRNA半衰期短，体外合成siRNA对基因表达的抑制作用通常是短暂的，因而使其应用受到较大的限制。采用事先在体外构建能够表达siRNA的载体, 然后转移到细胞内转录siRNA的策略，不但使脂质体有效转染的细胞种类增加，而且对基因表达抑制效果也不逊色于体外合成siRNA，在长期稳定表达载体的细胞中，甚至可以发挥长期阻断基因表达的作用。在所构建的siRNA表达载体中，是由RNA聚合酶Ⅲ启动子来指导RNA合成的，这是因为RNA聚合酶Ⅲ有明确的起始和终止序列，而且合成的RNA不会带poly A尾。当RNA聚合酶Ⅲ遇到连续4个或5个T时，它指导的转录就会停止，在转录产物3’端形成1~4个U。U6和H1 RNA启动子是两种RNA聚合酶Ⅲ依赖的启动子，其特点是启动子自身元素均位于转录区的上游，适合于表达～21ntRNA和～50ntRNA茎环结构（stem loop）。在siRNA表达载体中，构成siRNA的正义与反义链，可由各自的启动子分别转录,然后两条链互补结合形成siRNA；也可由载体直接表达小发卡状RNA(small hairpin RNA, shRNA), 载体包含位于RNA聚合酶Ⅲ启动子和4～5Ｔ转录终止位点之间的茎环结构序列，转录后即可折叠成具有1~4 个U 3 ’ 突出端的茎环结构，在细胞内进一步加工成siRNA。构建载体前通常要通过合成siRNA的方法，寻找高效的siRNA，然后从中挑选符合载体要求的序列，将其引入siRNA表达载体[ 12,13 ]。
然而不管是体外合成siRNA，还是基于载体的siRNA表达系统，其作用在很大程度上受到转染的效率的限制。事实上只有某些细胞系才可被有效转染，而对于原代细胞来说，几乎是不可能的。病毒载体仍然是目前常用的在细胞与整体水平进行基因转移的有效工具。逆转录病毒载体（retroviral vector）能够在哺乳动物细胞系和原代细胞进行稳定有效的基因转移。将人H1启动子克隆并插入逆转录病毒载体，构建了能够表达siRNA的逆转录病毒载体，该载体可以在被感染细胞中启动RNAi，有效抑制基因表达；更为重要的是，它能够整合到靶细胞基因组，长期稳定地抑制基因表达，甚至形成突变的细胞系；而且在原代细胞实现了高效率的基因转移，高滴度的病毒对人原代成纤维细胞感染率在99%以上，导致了靶基因的稳定失活[ 14 ]。慢病毒载体（lentiviral vector）较逆转录病毒载体有更广的宿主范围，慢病毒能够有效感染非周期性和有丝分裂后的细胞。用慢病毒自我失活（self-inactivation, SIN）载体构建的由H1启动子驱动增强绿色荧光蛋白 ( EGFP ) shRNA表达的载体，可以在2种稳定表达EGFP 的细胞系中有效地使EGFP表达沉默，这种效应起始于感染后3 d，并至少持续至感染后25 d[ 15 ]。新近报道的一种由小鼠U6启动子控制shRNA表达的慢病毒载体 ( pLL3.7 )，在其U6启动子下游紧接多克隆位点（MCS），为RNAi茎环结构序列的插入提供了方便；还可同时表达报告基因EGFP，便于对受感染细胞的观察。载体pLL3.7能够产生表达shRNA的高滴度的慢病毒，在周期性和非周期性细胞、干细胞、受精卵以及分化的后代细胞中表达shRNA，实现在多种类型的细胞和转基因小鼠中特异而稳定的基因表达的功能性沉默，为在原代的人和动物细胞组织中快速而高效地研究基因功能，以及产生特定基因表达降低的动物提供了可能性[16]。慢病毒作为siRNA的携带者，不但具备特异性地使基因表达沉默的能力，而且充分发挥了慢病毒载体自身所具备的优势，为基因功能的研究提供了更强有力的工具。
2 RNAi技术在神经科学研究中的应用
RNAi技术应用于神经系统基因功能研究，首先是在线虫和果蝇等低等的模式生物中进行的。Ataxin-2是人脊髓小脑共济失调II型(spinocerebellar ataxia type 2，SCA2)基因的表达产物，其功能尚未明确。Ataxin-2可以与一种RNA结合蛋白Ataxin-2结合蛋白1(ataxin-2-binding-protein 1，A2BP1)相互作用。Ataxin-2 和 A2BP1的序列在进化中较为保守，两者在线虫（Caenorhabditis elegans）的同源体分别为ATX-2和 FOX-1。为采用RNAi对其在线虫的功能特征进行研究，用注射或浸泡方式给线虫导入ATX-2和 FOX-1的dsRNA，结果成功地诱导了RNAi，并证明了Ataxin-2同源体在线虫早期胚胎发育中是必需的[17]。在神经系统发育过程中，基因家族的个别成员可能存在功能冗余，仅缺失基因家族某一成员的突变体，通常不会引起表型的显著变化。利用联合RNAi方法，给野生型果蝇胚胎注射神经受体酪氨酸磷酸酶基因家族4个成员的dsRNA，使这些基因表达被抑制，并以染料标记注射dsRNA后的胚胎成神经细胞，观察了多基因沉默对中枢神经系统轴突路径（axon pathway）所造成的影响[18]。给成年的果蝇腹内注射dsRNA，也可引起RNAi，并可作用于中枢神经系统表达的基因。通过腹内注射各自相应的dsRNA，成功抑制了成年果蝇中枢神经系统转基因LacZ和内源性基因GM06434的表达，表明这种RNAi技术方法可以用于成年果蝇中枢神经系统基因功能的研究，并且不会像突变研究那样造成对发育的干扰[19]。在果蝇神经肌肉接头(neuromuscular junction, NMJ)突触正常生长过程中，存在突触回缩（synapse retraction）现象。以RNAi筛选方法对这一现象的机制进行研究，发现dynactin复合体一个亚单元Arp-1/centractin对调节该现象有重要作用，Arp-1 dsRNA能够增强突触回缩。而dynactin复合体的另一成员P150/Glued的突变也可以产生同样的效应。Glued蛋白富含于突触前神经末梢，显性失活（dominant-negative）Glued转基因表达能够增强突触回缩。由此可见，dynactin对于促进突触的稳定性起着重要作用[20]。经过剪切可形成dsRNA的基因组cDNA杂交体( hybrid )，可以有效地使其针对的成年转基因果蝇的靶基因表达沉默。这些靶基因包括：lush，white 和 dGq(alpha)，其表达均出现严重降低，white RNAi表型与基因敲除突变之间不存在差别。该技术还可有效抑制表达于神经元中的基因，使之成为一种在活体成年果蝇特定细胞中敲除基因功能的简单策略[21]。给蜗牛体内注射合成的针对神经元型一氧化氮合酶(nNOS) mRNA的dsRNA分子，可以使之出现摄食行为的变化，并干扰了中枢神经系统一氧化氮(NO)的合成，这说明dsRNA可以用于以观察整体动物行为为目的的基因功能研究[22]。
siRNA以其在极低浓度下特征性的高效作用，已经成为在哺乳动物细胞中抑制（knock down）特定基因表达的有力工具。siRNA已应用于哺乳动物体细胞和胚胎细胞系，成功抑制一系列基因的表达。RNAi技术应用于哺乳动物神经系统基因功能的研究，首先是在一些神经系统来源的细胞系进行的。体外转录合成的siRNA、发卡状siRNA以及由含U6 siRNA表达载体在细胞内转录的两条siRNA链和发卡状siRNA，均可以显著降低小鼠P19细胞向神经元分化过程中神经元特异性β-tubulin蛋白的表达，其中以U6 siRNA表达载体形成的发卡状siRNA抑制作用最强，表明RNAi技术可以抑制神经元分化模型系统中神经元特异性基因的表达，有可能应用于哺乳动物神经分化与神经发生的研究[23]。通常认为，在哺乳类细胞中, 长于30 nt的 dsRNA能够诱导干扰素的表达和激活蛋白激酶，导致蛋白表达的广泛抑制和mRNA的非特异性降解，使RNAi的应用受到限制。而Gan等[24]的研究发现,以体外转录合成的平均大小约500-700 bp的dsRNA，可以特异地介导部分和完全分化后的小鼠神经母细胞瘤AGYNB010细胞中转基因和内源性基因表达沉默，针对绿色荧光蛋白（GFP）开放阅读框（ORF）的dsRNA，使GFP表达水平显著降低，而来源于内源基因多（ADP-核糖）聚合酶( PARP ) ORF的ds RNA则显著降低了PARP的表达。这一结果进一步提示，RNAi可以作为有效的工具应用于哺乳动物神经细胞基因功能的研究。
尽管在培养的线虫神经元，高浓度的dsRNA可诱导其靶基因表达降低，但是在原代培养哺乳动物神经细胞，siRNA的作用却不如其他类型细胞明显。这可能是由于RNA跨细胞膜转运或RNAi途径的不同造成的。在哺乳动物细胞系，化学合成的siRNA或表达siRNA质粒DNA, 一般是先与亲脂性试剂混合后再转染细胞，进而抑制基因表达。但是，对于分裂后原代神经元，转染效率较低，并且通常有细胞毒性，因而这些技术方法很难使siRNA在神经元中奏效。Krichevsky等[25]发现用阳离子转染试剂（TransMessenger transfection reagent），可以较容易地将合成的21 nt 微管相关蛋白2 (MAP2) 基因的siRNA导入培养大鼠大脑皮层与海马神经元，抑制了MAP2基因表达，表明RNAi在原代哺乳动物神经元是能够发挥作用的。短时间（2 h）低浓度（0.006~0.6 μg/mL）暴露于siRNA，即可造成内源性或外源性基因表达的抑制，而在此浓度范围的反义ssRNA，则不能抑制基因表达。更高浓度的siRNA/转染试剂，会对培养的神经元产生毒性。为研究转录因子心肌细胞增强因子2A（myocyte enhancer factor 2A，MEF2A）对小脑颗粒神经元存活所起的作用，利用以DNA载体为基础的RNAi技术，将由U6启动子控制下转录MEF2A hpRNA的质粒，在大鼠小脑颗粒细胞体外培养2 d后，以改进的磷酸钙转染法进行转染，转染3 d后以间接免疫荧光方法观察，发现MEF2A hpRNA有效而特异地降低了小脑颗粒细胞MEF2A蛋白水平；MEF2A hpRNA还显著抑制了小脑颗粒细胞内MEF2A依赖的基因转录活动和颗粒神经元存活。该研究进一步表明，RNAi技术可以成功地应用于分裂后哺乳动物神经元；以其相对简单，基于载体的RNAi方法为哺乳动物神经系统发育中基因功能研究提供了便捷的工具[26]。
以RNAi技术在成年转基因小鼠抑制外源基因表达的成功，促使人们在整体动物水平上运用该技术研究脑组织基因的生理功能。Makimura等[27]以RNAi技术研究了agouti相关肽 （agouti-related peptide，AGRP）对代谢功能的影响，将合成的siRNA注射于下丘脑弓形核，24 h后可以使AGRP mRNA降低50%，用能够在体内转录hpRNA的质粒pSUPER转染该区神经元，可以导致AGRP免疫反应性的更为持久的降低。该研究首次表明，RNAi可以被用于降低成年哺乳动物内源性基因的表达，评价在神经元表达的内源性基因所发挥的生理作用。进一步改进其表达系统，特别是结合基于病毒载体的基因转移方法，RNAi将会更为有效和持久地降低基因表达，成为研究哺乳动物基因尤其是表达于脑组织基因的生理功能的有力工具。
3 结语
迄今为止，反向遗传学依然是人们研究基因功能的最有效的手段。以同源重组为基础的基因打靶技术，是反向遗传学中普遍采用的方法，但它有着实验周期长、成本昂贵等缺点。反义方法如反义寡核苷酸和核酶技术，虽然能够在一定程度上弥补这些不足，但在实际应用中仍然受到很大的限制。在过去几年里，对RNAi的研究业已向人们展示了生物体存在一种崭新的调控机制。从单细胞原生动物到高等哺乳类，RNAi都为调控基因表达提供了全新的手段，无疑给实验生物学研究带来了一场革命[1,2]。
神经系统作为体内最为精密和复杂的系统，其基因表达与调控也存在着自身的特殊性与复杂性，使传统的反向遗传学方法在该领域的应用面临巨大的挑战。RNAi技术在神经系统基因功能研究的初步应用，表明了它在神经科学研究中应用不仅是可行的，而且有着广阔的前景。随着RNAi技术的不断发展与完善，如表达载体系统的更新、转染方式的改进，尤其是结合以逆转录病毒和慢病毒等病毒载体为基础的基因转移方式，RNAi技术必将在神经科学研究中得到最大限度的应用，给神经系统基因功能研究带来新的飞跃。
[参 考 文 献]
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[中图分类号] R338;R394.3 [文献标识码] A [基金项目] 国家自然科学基金（30200152,30271374）
[通讯作者] 潘虹，吴希如 [联系电话]（010）66171122-3236 [作者简介] 王汉森（1969 - ），男，山东人，博士后，主要从事发育中脑甲基化CpG结合蛋白2基因功能研究.
