NOV对人神经干细胞增殖和分化的影响
李成仁，李巍，蔡文琴，苏炳银，陈德英
（第三军医大学基础部组织学与胚胎学教研室，重庆 400038）
[摘要] 目的:探讨NOV蛋白对人神经干细胞(HNSCs)增殖和分化的影响。方法:NOV基因重组质粒转染COS-7细胞，收集COS-7细胞和NOV基因修饰COS-7细胞的条件培养液(COS-CM和NOV-CM)，作用于培养的HNSCs，3H-TdR掺入液闪检测HNSCs的增殖，免疫细胞化学和流式细胞仪检测HNSCs的分化。结果:(1) NOV-CM能明显促进HNSCs对3H-TdR的摄入，说明NOV-CM能明显促进HNSCs的增殖，另外NOV-CM的促细胞增殖作用具有一定的量效关系；(2)免疫细胞化学和流式细胞仪结果显示，NOV-CM促进HNSCs向神经元方向分化。结论: NOV蛋白可能具有促进HNSCs增殖和分化的作用。
[关键词] 肾母细胞瘤过度表达基因，人神经干细胞，增殖，分化
Effects of NOV protein on proliferation and differentiation of human neural stem cells
LI Cheng-ren, LI Wei, CAI Wen-qin, SU Bing-yin, CHEN De-ying
(Department of Histology and Embryology, Basic Medical College, Third Military Medical University, Chongqing 400038, China)
[Abstract] Objective:To explore effects of nephroblastoma overexpression gene(NOV) protein on proliferation and differentiation of human neural stem cells(HNSCs). Methods: After NOV was transfected into COS-7 cells with liposome method, conditioned mediums(CMs) of COS-7 cells and COS-7 cells modified by NOV gene were collected (COS-CM and NOV-CM, respectively). Proliferation of HNSCs cultured in the CMs was detected with incorporation of 3H-TdR, and differentiation of HNSCs was examined using immunocytochemistry and flow cytometry. Results: (1)NOV-CM markedly promoted incorporation of 3H-TdR to cultured HNSCs in a concentration-dependent manner, indicating that NOV-CM promotes proliferation of HNSCs. (2) NOV-CM increased differentiation of HNSCs to neurons, but decreased to astrocytes. Conclusion: NOV protein could promote proliferation and differentiation of HNSCs.
[Key words] nephroblastoma overepression gene; human neural stem cells; proliferation; differentiation
神经干细胞(neural stem cells, NSCs)的研究作为神经科学研究热点已近10年，人们不仅从胚胎和成年哺乳动物脑内分离培养了NSCs[1~4]，近年来研究证实在人的中枢神经系统内也存在NSCs[5~7]。我们曾成功地分离培养了人胚大脑皮层NSCs[8]。NSCs研究的迅猛发展，打破了中枢神经系统不能再生的传统观念，为许多以前棘手的中枢神经系统疾病如神经退行性疾病和中枢神经系统损伤的治疗带来了曙光。研究发现，许多因子如生长因子和营养因子，对NSCs的增殖和分化都具有重要作用。我们以前的研究显示肾母细胞瘤过度表达基因(nephroblastoma overexpression gene，NOV) 是神经系统发育的一个调控因子[9, 10]，NOV蛋白对人NSCs的增殖和分化有什么作用呢？本实验在分离培养人胚大脑皮层NSCs的基础上，研究NOV蛋白对其增殖和分化的影响，为人NSCs的研究和应用提供一些基础资料。
1 材料与方法
1.1 生物材料及试剂 自10~14周人胚大脑皮层培养的HNSCs,COS-7细胞,含NOV全长基因的pcDNA3.1/Myc-His(+)/lacZ重组质粒由本实验室培养和构建，DOTAP 脂质体转染试剂盒和G418购自Roche公司， 3H-TdR购自上海原子能研究所，NOV抗体(多抗)由法国Perbal教授惠赠，NF-200抗体(多抗)、GFAP抗体(多抗)和Gal抗体(多抗)均购自Sigma公司。SABC试剂盒、SABC-FITC和SABC-Cy3购自博士德公司。
1.2 方法
1.2.1 重组质粒转染培养的COS-7细胞和筛选 采用Roche公司的DOTAP脂质体转染试剂盒包裹重组质粒转染培养的COS-7细胞，按说明书操作。G418(500μg/ml)筛选14d后收集G418抗性细胞，调整细胞浓度后继续培养。转染了NOV基因的COS-7细胞简写成NOV/COS-7细胞。
1.2.2 Western Blot检测转染基因的表达 具体方法参照卢圣栋主编的《现代分子生物学技术》一书[11]。收集COS-7细胞和NOV/COS-7细胞条件培养液(conditioned medium, CM)以及细胞的裂解液，进行Western Blot检测。
1.2.3 COS-7细胞和NOV/COS-7细胞CM的制备与使用 生长状态良好的COS-7细胞和NOV/COS-7细胞，传代于50ml培养瓶中，细胞数约为106/瓶，培养48h待细胞生长稳定后以等量无血清培养基换液，继续培养24h，收集CM，简称为COS-CM和NOV-CM。将收集的CM用0.22μm孔径滤膜过滤，-20℃保存。使用时的剂量一般为整个培养液的一半，即将培养NSCs的培养液吸出1/2后再加入相同体积的CM。部分实验中设置了换液1/3或全换为CM的浓度组，即CM占最终液体量的1/3或全部(称1/3，1/2及全剂量组)。一般不作特殊说明时，CM占总培养液的1/2。
1.2.4 液闪检测HNSCs对3H-TdR摄入的影响 HNSCs按每孔105的细胞密度种植于24孔培养板，24h后分为对照组、COS-CM组和NOV-CM组，每组8孔，对照组不换液，COS-CM组和NOV-CM组分别用收集的COS-CM和NOV-CM换液一半，继续培养48h，最后24h加入3H-TdR(1μCi/孔)。另种植相应数量的HNSCs，培养24h后将细胞分为对照组和NOV-CM (1/3，1/2及全剂量组)，每组8孔，分别用对应液体量的NOV-CM换液，继续培养48 h，最后24h加入3H-TdR(1μCi/孔)，观察不同浓度CM对3H-TdR摄入的影响。用自动多头细胞收集器收集细胞于玻璃纤维滤纸，冲洗固定，80℃烤干，加入闪烁液，置于γ液体闪烁计数仪测cpm值。
1.2.5 HNSCs的分化 HNSCs按每瓶约5万的细胞密度种植于预先涂有多聚赖氨酸的50 ml培养瓶中(或每皿约1万的细胞密度种植于预先放有多聚赖氨酸涂布的盖玻片的35㎜培养皿中)，将细胞分为对照组、COS-CM组和NOV-CM组，每组三瓶。正常对照组仅含5%胎牛血清培养基，COS-CM组与NOV-CM组分别用收集的COS-CM和NOV-CM换液一半后加入5%胎牛血清，分化7d和14d后终止培养，进行免疫细胞化学或免疫荧光和流式细胞仪检测。
1.2.6 免疫细胞化学和免疫荧光染色 培养于盖玻片上的细胞，以4%多聚甲醛固定30min。采用抗NF-200(1∶1000 )、抗GFAP (1∶200 )和抗Gal(1∶200 )抗体分别标记神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。在免疫细胞化学染色中设阴性对照，用 PBS液代替一抗。具体方法参照蔡文琴主编的《实用免疫细胞化学与核酸分子杂交》一书[12]。
1.2.7 流式细胞仪检测 用0.125%胰酶消化培养瓶内的细胞，离心收集，4％多聚甲醛固定30min，PBS洗涤3遍后按1.2.5的方法行免疫荧光染色，用流式细胞仪(FACstar PLUS型， Becton Dickison公司，美国)检测，每组取3个样本，每样本计数10000个细胞。
1.2.8 统计学处理 结果以X±s表示，采用单因素方差分析进行统计学处理。
2 结果
2.1 Western Blot检测转染基因的表达结果 Western Blot结果显示，转染了NOV cDNA的COS-7细胞CM和细胞裂解液中均可检测到NOV阳性表达(Fig 1)。
Fig 1A: Differentiated 7 d in control group under a phase contrast microscope. B:Differentiated 7 d in NOV-CM group under a phase contrast microscope.C:NF-200 positive cells with SABC-Nickel ammonium sulfate staining 7 d after differentiated in control group.D:NF-200 positive cells with SABC-Nickel ammonium sulfate staining 7 d after differentiated in NOV-CM group.E:GFAP positive cells with SABC-Nickel ammonium sulfate staining 7 d after differentiated in control group. F:Gal positive cells with SABC-DAB staining 7 d after differentiated in control group.
2.2 液闪结果 液闪计数检测显示，COS-CM组和NOV-CM组的HNSCs的cpm值较对照组有明显的增加(P<0.01)，即COS-CM和NOV-CM均能明显促进培养HNSCs对3H-TdR的摄入，说明COS-CM和NOV-CM均能明显促进HNSCs的增殖。其中NOV-CM组的cpm比COS-CM组要高(P<0.05)，说明NOV-CM中含有促进HNSCs增殖的成分。两种因素处理24h后3H-TdR摄入的检测结果见Tab 1。另外,液闪结果也显示NOV-CM的促HNSCs增殖作用具有一定的量效关系，在NOV-CM占换液量1/3以上时就能明显地促进HNSCs对3H-TdR的摄入，随换液中CM比例的增加，cpm值也越大，检测结果见Tab 2。
Tab 1 Effects of two CMs on the proliferation of HNSCs
Group n cpm
Control 8 3684±280
COS-CM 8 4958±184**
NOV-CM 8 6185±339**＃
**：P<0.01 vs control；＃：P<0.05 vs COS-CM
Tab 2 Relation between concentration and effects of NOV-CM on promoting proliferation of NSCs
Group n cpm
Control 8 3684±280
1/3 8 5121±184**
1/2 8 6185±339**
T 8 7512±362**
**：P<0.01 vs control
N: Normal; 1/3: 1/3 NOV-CM; 1/2: 1/2 NOV-CM; T: Total NOV-CM
2.3 HNSCs分化的形态学观察 在相差显微镜下，各组培养孔在分化第7天和14天在HNSCs球周围均可见到三种类型的细胞：(1)具有多个粗长突起的星形胶质细胞样细胞，细胞体较大，排列紧密，折光性弱； (2)具有一两个或多个突起，胞体呈圆形或椭圆形的神经元样细胞，细胞体较小，突起短而少，细胞排列疏松，折光性强；(3)具有多个细突起且不断分枝的少突胶质细胞样细胞，细胞体较小。星形胶质细胞样细胞和神经元样细胞一般围绕着HNSCs球呈放射状排列，少突胶质细胞样细胞一般在位于分化细胞的最外面单独分布或成群分布。在对照组和COS-CM组培养孔可见到较多星形胶质细胞样细胞，在它们中间或细胞上可见到神经元样细胞，在NOV-CM组可见到较多的神经元样细胞(Fig 2A,B)。
Fig 2 Western Blot of NOV protein in COS-7 cell and NOV/COS-7 cell. A：COS-7lysis buffer；B：COS-7 cell CM；C：NOV/COS-7lysis buffer；C：NOV/COS-7 cell CM
2.4 免疫细胞化学和免疫荧光染色结果 染色结果证实了上述形态学结果，在各组均可见有NF-200，GFAP和Gal阳性细胞。NF-200阳性细胞胞体较小，染色深；GFAP阳性细胞，胞体较大，染色较浅；Gal阳性细胞胞体较小，染色较深。在NOV-CM组可见到较多的NF-200阳性细胞，细胞突起较长，互相连接成网格状结构，在对照组和COS-CM组可见到大量GFAP阳性细胞（Fig2C,D,E,G）。
2.5 流式细胞仪检测结果 结果显示在对照组中GFAP阳性细胞数量较多，加入COS-CM后GFAP阳性细胞和NF-200阳性细胞数量未见明显变化（P>0.05）；NOV-CM组GFAP阳性细胞数量明显减少，NF-200阳性细胞数量明显增加（P<0.05）；各组之间少突胶质细胞数量相差不显著（P>0.05）。具体结果见表3。
Tab 3 Counts of differentiation of NSCs using flow cytometry
NF-200 GFAP Gal
Group n
7 d 14 d 7 d 14 d 7 d 14 d
Control 3 35.68±3.05 21.74±2.47 47.63±3.24 59.78±4.06 5.47±0.73 7.35±0.78
COS-CM 3 36.74±3.47 23.35±3.58 49.38±2.74 63.54±3.75 5.26±0.82 8.08±0.98
NOV-CM 3 56.85±4.36* 40.95±3.60* 38.65±2.96* 47.40±5.52* 6.04±0.72 5.46±0.87
*：P<0.05 vs control
3 讨 论
自从1992年NSCs分离、培养成功后，就成为神经科学研究领域中的热点。研究证实在人的中枢神经系统内也存在NSCs[5~7] ，我们也已成功培养了HNSCs[8]。NSCs的基础资料如其增殖和分化及调控机理，成为人们需要研究的首要问题。它可以为神经系统发育和调控提供有价值的资料，并可为NSCs的临床应用提供理论依据。许多中枢神经系统疾病如帕金森病、Alzheimer’s病、损伤等都有大量的神经元退变和丢失，至今尚无有效的治疗措施。NSCs在体内和体外均能被诱导分化成神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。如果我们用人为的因素进行干预，首先促进NSCs增殖，然后诱导NSCs向神经元方向分化或者增加分化成神经元的比例，NSCs移植有望成为治疗多种中枢神经系统棘手疾病的理想方法。NSCs的分化可能存在外来信号调控和细胞自身基因调控两种机制[13]。外来信号中，NSCs的生存微环境决定了干细胞的分化命运。即使同一来源的NSCs移植到不同的分化部位后其分化结果也不相同，但均与接受移植部位的细胞相似，这一现象提示了外来信号调控作用的重要性[14]。目前研究表明，胰岛素、胰岛素样生长因子-I(insulin like growth factor，IGF-I )、骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)的BMP-2和BMP-4可刺激神经元的发生[15]；脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor,BDNF)可刺激神经元前体细胞分裂，但在促进细胞分化中的作用还不确定；睫状神经细胞营养因子(CNTF)作用于鼠的干细胞，使其向星形胶质细胞分化，而在人胚中CNTF则促进NSCs分化成神经元；血小板源性生长因子(PDGF)则明显减少人胚胎NSCs分化成神经元的比例，这与在鼠中观察的结果也相反；视黄酸(RA)可以提高NSCs内p21表达，使NSCs退出细胞周期，进入分化，成为神经元[16]。本实验利用分离培养成功的HNSCs，用COS-CM和NOV-CM诱导其分化，以观察NOV蛋白对HNSCs分化的作用。流式细胞仪和免疫细胞化学结果显示COS-CM对HNSCs的分化作用不显著，而NOV-CM可促进HNSCs向神经元方向分化。分化出来的神经元突起较长，提示NOV蛋白除了促进HNSCs向神经元分化，还可能对新分化来的神经元的突起生长有一定的促进作用，此结果与我们以前在大鼠NSCs上的结果相类似[17]。
NOV蛋白是一种胰岛素样生长因子(IGF)结合蛋白，属于IGF家族的成员。它通过调节IGF与IGF受体的结合状态而对IGF的功能发挥调控作用[18]。NOV可能是通过调节IGF的作用来影响NSCs的分化，也可能NOV本身也有促进NSCs向神经元方向分化的作用。我们以前研究的一些线索显示NOV基因可能参与CNS损伤后的再生和修复过程[9, 10]，提示可以将NSCs和NOV进行联合应用，从而促进CNS损伤的修复。但在HNSCs应用于临床之前仍有大量的研究工作需要进行。
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