神经营养因子及其受体的基因突变与疾病
朱伟,路长林,何成
(第二军医大学神经生物学教研室,上海 200433)
摘要:神经营养因子在神经系统发育和生理功能发挥中具有重要作用。神经营养因子及其受体的基因缺失及突变是导致某些人类疾病,如各种先天性发育不全、神经退行性疾病和癌症等的“候选基因”或“修饰基因”, 本文综述了神经营养因子及其受体突变与疾病的关系。
关键词:神经营养因子;神经营养因子受体;基因突变
中图分类号:Q 文献标识码:
Mutations of neurotrophic factors and neurotrophic factor receptors in human diseases
ZHU Wei,LU Chang-lin,HE Cheng
(Department of Neurobiology, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China)
Abstract:Neurotrophic factors are critical to the development and function of the nervous system. Mutations of neurotrophic factors and their receptors will lead to many human diseases such as agenesis, neurodegenerative disorder and cancer. This paper reviews the “candidate genes” and “modifier candidate genes” of neurotrophic factors and their receptors to the related human diseases.
Key words:neurotrophic factor; neurotrophic factor receptor; mutation
在胚胎发育中,前体细胞发送并接收信号, 或向更高的分化阶段发展,或趋向凋亡。绝大多数物种在神经系统分化形成高一级功能单位的模式上都是保守的,都离不开包括神经营养因子在内的促神经元存活和分化的各种细胞因子的作用。正因为了解神经营养因子具有极端重要性,人们开始对人类疾病如先天性发育不全、神经元退行性疾病和癌症与神经营养因子及其受体的基因缺陷、表达水平和功能状态之间的关系展开大量的研究,并提出其中一些基因缺失或者突变可能是导致某种疾病的“候选基因”或“修饰基因”。本文就神经营养因子及其受体基因突变与疾病的关系作一综述。
神经营养因子的表达与作用并不限于成熟神经元,甚至也不限于神经系统;而非神经元生长因子也有
许多在脑内表达,并对胚胎发育阶段或成熟后的神经组织有作用。根据分子结构、受体类型等可将神经营
基金项目: 通讯作者:何成 作者简介:朱伟(19??年生-),女,硕士研究生,从事神经营养因子及其受体的信号转导研究. E-mail:chenghe@online.sh.cn 联系电话: 收稿日期:--
养因子家族(neurotrophic factor,NTFs)分为神经营养素家族(neurotrophin, NTs)、神经细胞因子家族(neurocytokine family)和胶质细胞源性神经营养因子家族(glia cell line-derived neurotrophic factor family)等多个家族 [1,2]。
NTs家族又称为NGF家族,包括NGF,BDNF,NT-3,NT-4/5和NT-6,NGF家族受体为低亲和力的75kD神经营养素受体(p75NTR)和高亲和力的Trk酪氨酸激酶受体家族。p75NTR受体可以经以下Trk依赖途径(Trk激活状态时):发挥其作用(1)激活转录因子NF-κB或与TRAF激活Akt途径与Trk协同促细胞存活;(2)选择性抑制Raf-MEK-MAPK途径同时提高胞内神经鞘氨醇水平,或激活生长调节蛋白Rho来抑制细胞的生长。p75NTR受体还可以经Trk非依赖途径(Trk失活或活力下降时):通过JNK-p53-Bax途径或通过结合锌指蛋白NRIF发出凋亡信号,介导细胞凋亡,这一作用,可被激活的Trk信号转导所终止[1,2]。睫状神经营养因子(ciliary neurotrophic factor,CNTF) 是神经细胞因子家族的重要代表。CNTF属于成血细胞因子超家族,CNTF受体主要由结合配体的CNTFRα和功能性受体LIEFβ和gp130组成,通过激活JAK-STAT途径进行信号转导。胶质细胞源性神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophic factor, GDNF)属TGF-β超家族,是胶质细胞源性神经生长因子家族的重要代表,目前该家族还包括neurturin(NTN),persephin(PSP)和artemin(ART)3个成员。 GDNF 家族信号转导主要通过与各自特异性GFRα受体(GFRα1~GFRα4)和酪氨酸激酶受体Ret结合形成受配复合物后,引起Ret磷酸化从而激活下游信号转导[1,2]。
1 NGF家族及其受体基因缺失、突变与疾病
1.1 NGF家族及其受体基因敲除 从Tab 1看,NGF及其受体基因缺失将会严重影响神经系统的发育,甚至发生个体的死亡。TrkA,TrkB,TrkC,BDNF和NT-3基因缺失均为致死性的,说明它们在神经系统发育中有不可替代的重要作用。NGF的作用可能通过NT-3-TrkA来代偿,NT-4/5的作用可能通过BDNF-TrkB加以代偿,但TrkA,B,C受体一旦缺失,作用无法替代。而p75NTR仅在外周感觉和交感神经活动中起部分作用,并非神经系统发育所必需[3,4]。
Tab 1 Main defects observed in the targeted disruptions of neurotrophins and their receptors (Snider 1994; Barbacid 1995)
Phenotype p75 NGF TrkA BDNF TrkB NT-3 TrkC
Neuronal loss some severe severe severe severe marked marded
Sup cerv ganglia no 95% 95% no no 50% 25%
Trigeminal ganglia no 70% 70% 40% 90% 60% ?
Nodose-petrosal g ? no no 85% ? 40% ?
Vestibular ganglia ? ? ? 30% 30% 20% ?
Dorsal root ganglia yes 70% 70% no no 65% 20%
Function
Nociception partial low low normal normal normal normal
Balance normal normal normal poor ? normal normal
Proprioception normal normal normal normal normal poor poor
“?”, unknown; “yes”, defect positive; “no” , defect negative
1.2 NGF家族及其受体基因的突变与疾病 早在1994年Smeyne就通过动物模型证实NGF通过TrkA促进神经系统发育中感觉和交感神经元的存活[5]。1996年后Indo等人更进一步证实了TrkA突变是造成人遗传性感觉和自主神经性病变Ⅳ型(先天痛觉不敏感及缺汗症,CIPA)的分子学基础,这种病由于NGF-TrkA通路受阻,引起交感神经元缺失、体温调节障碍、体温过高的缺汗症症状,以及无髓鞘痛觉感觉神经元缺失造成痛不敏感和自我伤害症状。另外,CIPA病人还伴有严重的智力退化,提示NGF-TrkA信号转导通路对于认知与记忆等脑的高级功能也是必不可少的[6,7]。
突变除了能引起TrkA功能低下或失活而导致先天性的神经系统疾病外,还可能因为突变引起TrkA组成性活性增强而导致肿瘤的形成。早在1986年,Trk就被作为一种癌基因从人结肠癌细胞中提取出来[8]。虽然在以后的研究中并未发现Trk作为癌基因表达是导致临床结肠癌发病的病因,但有研究发现TrkA或TrkC与其他蛋白一起形成的融合蛋白可以发生同源二聚化,造成酪氨酸磷酸化激酶恶性激活:TrkA的这种恶性激活可以导致甲状腺癌的发生[9];而TrkC的恶性激活则可导致纤维肉瘤或者白血病[10]。由此可见,Trk受体基因的正确定位和表达后的正常活化对于维持Trk介导的正常生物学反应是必需的,这一点与下面介绍的Ret基因重排后引起甲状腺乳头状腺癌的发生机理极其相似。虽然精神病的发生可能与NTs/Trk信号转导失常有关的假设早有人提出,但一直未被有力的证据证实。Down综合征是一种典型的染色体异常疾病,症状表现为极早出现智力退化和神经功能异常,最后演化为早老性痴呆。从Ts16小鼠(Down综合征的动物模型)取材的海马神经元体外培养发现:给予BDNF未能产生与正常对照组一样的促存活效应,且过量表达一种截短且同时丧失TK激酶活性的TrkB受体。将这种突变的TrkB受体转入正常神经元中表达可再现Ts16神经元BDNF信号转导受阻现象,而将腺病毒介导的正常TrkB受体基因转入Ts16神经元则又可以恢复BDNF的促存活效应[11]。联系以往BDNF对多种神经元尤其是5-HT神经元促存活作用和对神经突触可塑性的调节作用的认识,不难理解BDNF/TrkB信号转导受阻常会引起发育障碍、智力退化或精神行为上的异常表现。近来的一项研究通过基因连锁分析提示精神分裂症与BDNF基因突变(GT脱氧核苷酸重复序列和V66M点突变)有关[12]。2003年 Bai Lu实验室通过fMRI,1H-MRSI和认知检测等体内实验手段证实BDNF基因V66M突变组人群情景记忆(陈述性记忆)能力和工作记忆(非陈述性记忆)所依赖的海马神经元去活化能力明显低于对照组人群;海马N-乙酰天冬氨酸水平检测显示BDNF基因V66M突变组人群较对照人群海马神经元完整性和突触的数量均有下降;体外两种基因型BDNF基因转染的海马神经元模型荧光显微形态观察、ELISA 及Western Blot 检测显示BDNF(V66M)突变组神经元BDNF胞内转运出现障碍,虽然BDNF组成性分泌正常,但神经元活性依赖性分泌明显低于对照组。虽然Lu等的研究并未能给出BDNF基因突变与精神行为紊乱关联的直接证据,但BDNF(V66M)基因突变引起海马功能和记忆能力下降的这一发现不但对精神分裂的研究极有价值,更对早老性痴呆、脑损伤、各种心理性疾病,甚至正常的老龄化引起的海马功能和记忆能力下降的分子基础给出探索性提示[13]。
2 CNTF及其受体基因的缺失、突变与疾病
2.1 CNTF及其受体基因敲除 CNTF基因敲除小鼠出生后神经系统发育似乎正常,但成体后,出现运动神经元萎缩,数量减少,肌力降低,表明CNTF并非神经系统发育所必需,但在维持成体运动神经元的生存和正常功能中起重要作用[14]。CNTFRα敲除小鼠比CNTF基因敲除小鼠情况严重得多,表现为严重的运动系统功能丧失,出生后即死亡。这一点不同提示我们:发育中可能有另一种也以CNTFRα为结合受体的、类似CNTF的配体存在[15]。
2.2 CNTF及其受体基因突变与疾病 由于CNTF对运动神经元和去神经支配的骨骼肌的营养作用,启发人们开始研究CNTF突变与肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)之间的关系。Takahashi [16]和Orrell[17]各自通过研究证实ALS病人CNTF基因存在一个G→A的点突变,虽不引起氨基酸错译,却能因此形成新的mRNA剪接位点,在原来的CNTF编码区内多出4bp的插入小片段,令正常的CNTF蛋白无法表达而代之以异常蛋白表达。但同时Takahashi又在391名随机挑选的日本人中发现该点突变的正常纯合基因型占61.9%,杂合型35.8%,突变纯合型2.3%,这个分布比例在神经系统
疾病包括ALS疾病人群中也非常接近。Orrell也在49个ALS患者家庭中进行调查,发现正常纯合基因型占65%,杂合型35%,无1例突变纯合型。以上两项在不同人种中用不同方法进行的研究不约而同地得出了一个非常类似的基因分布比例,提示CNTF的这个点突变更可能是一个等位基因,而不是致病的基因突变位点。SOD-1 基因已证实为ALS特别是家族性ALS的候选基因,Giess在此基础上通过对一个FALS家庭成员发病早晚和病程长短的研究,提出CNTF可能是ALS疾病的候选基因SOD-1的修饰基因,它的作用表现为令发病期过早提前,病程缩短,迅速死亡。Giess除了在提前发病的ALS病人身上发现纯合型CNTF突变基因,而晚发病的亲属身上并无此表现之外,还通过对CNTF-/-敲除小鼠与hSOD-1(G93A)突变小鼠杂交后小鼠后代ALS发病情况的调查,得出同人ALS疾病中观测到的相似结果。另外,自发性ALS病人伴有CNTF纯合型突变基因也会出现发病期显著提前,但病程没有明显缩短[18]。由此可见,疾病与基因突变的关系不仅不局限于单个或多个候选基因引起发病,同时在发病的调控上还有修饰基因的参与,这令基因突变与疾病的关系研究变得更复杂。
3 GDNF家族及其受体基因缺失、突变与疾病
3.1 GDNF家族及其受体基因敲除 GDNF配体家族与GFRα-Ret三聚体受配复合物的形成对于体内神经元发育十分重要。GDNF-/-和GFRα1-/-小鼠与Ret-/-小鼠表型类似,即出生后不久就死于肾脏发育不全和胃肠道神经支配缺失,但Ret-/-小鼠还表现出颈上神经元缺失,但在GDNF-/-和GFRα1-/-小鼠中却表现正常或影响很小[19~22]。在NTN-/-或GFRα2-/-小鼠中,肠道、泪腺和唾液腺的副交感胆碱能神经元支配均显著减少[23]。GFRα3-/-小鼠颈上神经元严重缺损而其他神经节神经元正常[24]。
3.2 GDNF家族及GFRα受体基因突变与疾病 Gerlai提出GDNF杂合型基因突变小鼠成年后黑质纹状体多巴胺能神经元发育无异常表现,但这些杂合型基因突变小鼠在Morris水迷宫实验中表现出空间认知功能上有缺陷,提示GDNF并非多巴胺能神经元发育所必需,但是GDNF对于维持脑高级功能似乎不可缺少[25]。人类先天性肠道神经节缺损一般发生在结肠远端,如Hirschspring’s Diease(HSCR),严重的会累及小肠。Angrist 等人在300名HSCR病人中发现7名病人GDNF基因存在5种以下不同杂合型基因突变,这些突变在一些正常人身上也存在。而且发现一名父亲与孩子均为同一种GDNF基因突变纯合型,但孩子发病而父亲正常,说明GDNF基因可能不是HSCR的候选基因[26]。Myers在269名HSCR病人中发现10处GFRα1多态现象,但未发现有氨基错译的突变存在,提出GFRα1可能也不参与引起HSCR的病因事件[19]。Zhou . 在394名Hallervorden-Spatz综合征(脑内钾离子堆积神经退行性疾病Ⅰ型,NBIA1)病人中发现h GFRα4基因存在C39S和P145S两个点突变与NBIA1发生有关,认为h GFRα4是引起NBIA1的候选基因[28]。
3.3 Ret受体基因突变与疾病 GDNF家族另一个受体Ret是由原癌基因RET编码的酪氨酸激酶跨膜受体。原位杂交显示RET无论在胚胎还是成年小鼠的外周、中枢神经系统以及排泄系统等均有表达,Ret作为GDNF的功能受体一旦激活可以通过下游的RAS/ERK和IP3K/Akt途径,促进细胞的存活和分化。近来发现PI3K途径还可激活下游许多其他信号分子如Rac,FAK等,分别与细胞生成伪足、细胞黏附和形成应力纤维有关[29]。综上所述,Ret对于促进细胞存活、分化、维持运动功能均有不可忽视的作用。事实上,对人类许多疾病及相关动物模型的研究显示:这些疾病的发生都与RET基因缺失或突变引起Ret功能失活或过分激活有关。
3.3.1 RET基因重排与PTC 甲状腺乳头状腺癌(PTC)是典型的甲状腺肿瘤,占所有甲状腺恶性肿瘤的80%。意大利、美国、法国、日本的研究分别检出4/42,17/101,8/70和2/49例PTC存在RET基因重排,并根据重排形式的不同分为Ret/PTC1-Ret/PTC4和Ret/ΔPTC3五种类型。切尔诺贝利核事故辐射区甲状腺癌呈增长趋势,60%年轻PTC患者发生RET基因重排,且主要以Ret/PTC1和Ret/PTC3两种形式居多,粘染地区儿童甲状腺癌的发生也与这两种形式的基因重排成正相关。体外实验也表明,经X射线照射的人未分化甲状腺细胞8505C和纤维瘤细胞HT1080也发现RET重排[30]。另外,在4/19例甲状腺滤泡状腺癌病人中也发现RET重排,而528例非甲状腺癌组织无1例发生RET重排。这些都表明RET基因重排和PTC等腺癌的发生有关[23]。重排基因产生的变异Ret能识别除GDNF家族配体外的无关配体信号,引起变异Ret二聚化后激活酪氨酸激酶活性,启动细胞进入有丝分裂,导致腺细胞无限增殖及恶变[31]。
3.3.2 RET基因突变与MEN2和FMTC 遗传性多发性内分泌腺瘤2型(MEN2)包括MEN2A,MEN2B,家族遗传甲状腺癌(FMTC)。MEN2A是常染色体显性癌症,表型特征为甲状腺髓样腺癌和噬铬细胞瘤。约10%~30%的MEN2A病人亲属也会有甲状旁腺肿大。MEN2B病人通常较早就出现甲状腺髓样腺癌症状且伴有更为复杂的综合征,如噬铬细胞瘤、黏膜神经瘤、胃肠道神经节瘤和骨骼畸形。FMTC特征为甲状腺髓样腺癌晚期恶化症状。MEN2基因型与表型间存在对应关系,如Tab 2所示。MEN2A突变位点主要在临近跨膜区的CyS富含区,当参与二硫键形成的一个Cys突变后,另一个 Cys得以解脱出来,与第二个Ret突变分子的Cys形成二硫键,并导致TK区组成性激活[31,32]。MEN2B突变发生在TK区,95%以上的MEN2B病人发生M918T点突变,4%以下的病人发生了A883F点突变。近来有报道在日本MEN2B(4级)恶性较高的病人中又发现了同在一个遗传基因上的V804M和Y806C两个点突变。MEN2B突变虽然发生在TK区,但令人惊讶的是:Ret的酪氨酸激酶活性不但不减弱反而较野生型增强。研究发现Ret(MEN2B)不同于Ret(MEN2A),Ret(MEN2B)是以单分子方式发生激活,可能因为突变引起TK激酶活性中心构型变化,令其不再需要二聚化就能发生TK激活[33]。另有研究提示,MEN2B突变可以改变Ret对下游底物分子的专一性,但新的转导途径对形成MEN2B临床表型的重要性尚不清楚[28]。FMTC突变位点既有发生在CyS富含区也有在TK区。还有报道说分别在2个MEN2A家族和1个FMTC家族的RET外显子8区和11区发现9个和12个碱基对的重复序列,以至表达的Ret比原来多了一个Cys,导致非正常的二硫键形成,但因为缺少相关报道而无法进一步确证[32]。Tab 2中还给出了不同酪氨酸对Ret(MEN2A)和Ret(MEN2B)向MEN2A和MEN2B表型转化的不同影响。如:Y905是MEN2A表型转化所必需,而Y952,Y864是MEN2B表型变化所必需。Y1062因为参与激活下游Ras/ERK,PI3K/AKT,JNK,p38MAPK和MEK5/BMK1等多条信号转导途径,故是MEN2A,MEN2B,FMTC表型转化均不可缺少的酪氨酸位点[34]。
Tab 2 Characterization of RET with MEN2A , MEN2B or FMTC mutations
Mutations Transforming activity Disulfide-linked dimerization Tyrosine required for transforming activity Phentype
C634X* High Yes Y905, Y1062 MEN2A, FMTC
C609X
C618X Low-intermediate Yes Y905, Y1062 FMTC, MEN2A
C620X
E768D
V804L Low No Y905, Y1062 FMTC
S891A
M918T
A883F High No Y864, Y952, Y1062 MEN2B
V804M
Y806C
3.3.3 RET基因突变与HSCR HSCR是有关RET基因突变研究最多、最早的一种人类发育缺陷疾病。研究显示,50%家族性HSCR和10%~20%自发性HSCR均与RET基因突变有关,且75%的HSCR均与Ret长片段同型蛋白的突变有关[34]。由Fig 1可见,HSCR基因突变可能发生在胞外区、TK区和C端的各处,分别通过影响Ret在膜上的表达、酪氨酸激酶活性丧失和影响SHC接头分子结合三方面影响Ret对信号的转导功能。Inoue在15名严重结肠神经缺损累及小肠的病童中发现了8种Ret基因突变,且5种突变在TK区,未发现GDNF及NTN基因突变。与一般HSCR病人相比,这些病人Ret基因突变率更高、TK重要功能区突变率更高、临床症状也更为严重[35]。Sakai在28名日本自发性HSCR病人中检测到Ret和EDNRB(内皮素受体B)基因突变,而未见有NTN及EDN基因突变,提示HSCR发病机理虽很大程度上与RET基因突变有关,但仍不排除其他重要基因参与的多基因协同作用[36]。近来,有报道发现一名先天性脑水肿同时伴有HSCR病症的男婴,虽未检测出RET基因突变,但发现L1CAM神经细胞黏附分子G2254A点突变,认为L1CAM可能是引起HSCR的修饰候选基因,通过影响肠神经元在肠道中的粘附,加速肠神经元缺损表型的形成[37]。 HSCR偏重在男性身上发生以及RET基因突变只占HSCR病者的50%的事实,提示我们HSCR还有更多的侯选基因和修饰基因存在。Puri等还提出,胞外基质及肠神经元的靶细胞-肠平滑肌细胞对于肠神经元的分化和神经支配的建立具有重要作用,提示胚胎发育的微环境的变化对于HSCR发生的影响也十分重要[38]。可见,HSCR是一种复杂的,由多基因、多因子诱导的疾病。
Fig 1 Characterization of RET with HSCR mutations
Mulligan[39]和Decker[40]先后报道在一些家族性MEN2A同时伴有HSCR病人中,发现RET 基因C609,C618,C620处发生突变,这三个部位的点突变在其他有关MEN2A基因突变中已有报道(见Tab 2)。但令人费解的是同样这些突变不仅可以引起Ret异常激活导致细胞恶性增殖以至癌变,还能引起相反效应:Ret活性丧失导致肠神经缺损。Rajan[41]等也报道,体外RET(MEN2B)突变基因转入GDNF-/-或GFRα-/-小鼠体内,仍然不能阻止神经节瘤和肠道神经缺损的发生。对此,Takahashi认为C609,C618,C620三个半胱氨酸中任何一个突变都可能导致双重效应发生,突变发生在不同细胞类型会有不同的最终表现,如突变发生在肠神经前体细胞则表现为HSCR症状,发生在甲状腺细胞则表现为MEN2/FMTC症状[,42]。
3.3.4 RET基因突变与CCHS 先天性中枢肺换气不足综合征(CCHS)是一种罕见而独特的疾病。CCHS通常与其他神经嵴细胞病变疾病相联系,尤其是HSCR。CCHS病人HSCR发病率很高,而RET,EDNRB是导致HSCR最主要的突变基因,已证实它们和神经嵴细胞的增殖、分化和迁移有关,因此多年来许多研究均围绕CCHS与RET及EDNRB 基因突变之间的关系展开。目前,大多数研究并未发现CCHS病人RET及EDNRB基因有氨基酸错译的突变。但最近Kanai等人报道在一名日本CCHS病人中发现了一个R114H的点突变并排除了等位基因的可能,认为这个点突变与CCHS发病有关[43]。
3.3.5 RET基因突变与其他疾病 动物实验表明Ret和GDNF发挥正常功能对精母细胞减数分裂形成精子十分重要,RET基因缺失或突变会造成精子发育不良[44]。另外如前所述,Ret对于肾脏输尿管芽形成及肾组织器官发育均很重要,一旦缺失会造成肾发育缺损、功能不全,个体无法维持生命。
总之,神经营养因子及其受体基因突变与疾病的研究能帮助我们更好地明确神经营养因子及其受体的重要功能位点,无论对神经营养因子与受体信号转导的作用模式研究还是对基因突变导致疾病的临床治疗都非常有价值。
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