GABA受体在脑缺血中的作用
甘平1,程介士1
(1. 复旦大学医学院神经生物学国家重点实验室,上海 200032)
摘要: GABA是哺乳类动物中枢神经系统中的一种抑制性氨基酸递质,通过其三种受体发挥生理作用。随着对脑缺血损伤机制的研究,科学工作者发现,GABA的三种受体在脑缺血损伤与修复中发挥了重要的作用。本文对GABA的受体与脑缺血中的关系做一综述。
关键词:GABA受体;脑缺血;损伤与修复
中图分类号:Q 文献标识码:
Effect of GABA receptors on the brain ischemia
GAN Ping1, YANG ru2, CHENG Jie-shi 1
(1. The Key National Neurobiology Laboratory of Medical College of Fudan University , Shanghai 20032,China)
Abstract:GABA is an important inhibitory neurotransmitor in mammal CNS, which produce effect by its three receptors. More evidence indicates GABA receptors play important roles in brain ischemia injury and repair. This view will discuss different roles of GABA receptors in brain ischemia injury and recovery.
Key words:GABA; brain ischemia; injury and recovery
GABA是哺乳类动物中枢神经系统中的一种抑制性氨基酸递质,与受体载体结合后使神经元产生突触前或突触后的抑制。GABA在半个世纪前分别由两个实验室独立地从脑萃取物中鉴定出来,这两个实验室分别是由Eugene Roberts和 Awapara领导的[1,2]。GABA在脑缺血中具有神经保护作用,但其受体的作用机制还有待阐明。 GABA受体分为GABA-A,GABA-B和GABA-C3种亚型。
1 GABA受体简介
1.1 化学结构和分型 GABA-A受体分布于整个神经系统, 属配体门控离子通道受体, 由GABA识别位点、安定识别位点和Cl-通道三部分组成。GABA-A受体具有a1~6, b1~4, g1~4, g2l, g2s, g3, d, e等亚单元,每个GABA-A受体由四种共5个亚单元(如2a2b1g等)组成,每个亚单元由具有四个跨膜螺旋(M1, M2, M3,
M4)的长肽链组成。GABA-B受体不及GABA-A受体丰富,但小脑皮层及脚间核以GABA-B受体为主。GABA-B
基金项目: 通讯作者:程介士 作者简介:甘平(1972-),女,昆明人,复旦大学上海医学院神经生物学国家重点实验室研究生. E-mail: 联系电话:(021)54237521 收稿日期:2003-04-07
受体是GABA的自家受体,从药理学上把GABA-B受体分为GABA-B1和GABA-B2受体,GABA-B1在大脑皮层对激动剂3-APPA和baclofen都敏感,而在脊髓水平对3-APPA敏感而对baclofen不敏感。GABA-B1受体又可以分为GABA-B1b和GABA-B1g异源受体。GABA-C由r1和或r2亚单元组成。
1.2 作用特性 GABA-A兴奋时打开Cl-通道,Cl-内流使突触后膜超极化,引起一种快IPSP。GABA-B受体则与钾通道偶联,激动时通过一种百日咳毒素敏感的G蛋白(G/G) 打开钾通道,使突触后膜超极化,引起慢IPSP。但由于GABA-B受体主要分布于突触前末梢,与GABA和baclofen高亲和性地结合,通过激动位于膜上的G蛋白,抑制Ca2+内流,在突触前抑制兴奋性氨基酸的释放而产生抑制效应。GABA-C受体对GABA较为敏感,发生效应缓慢,作用持久不易失敏,其效应不能被荷包牡丹碱(bicuculline,Bic)阻断,也不被苯二氮卓类(BZ)药物所加强,但可被拮抗剂印防己毒素(picrotoxin,PTX)和14AA阻断。
1.3 激动剂及拮抗剂 GABA-A受体选择性激动剂:蝇覃醇(muscimol)作用比GABA强10倍以上。THIP(4,5,6,7,-四氢异恶唑[5,4,-C]-吡啶酮-3醇)是蝇蕈醇的同类物,毒性较低且具镇痛作用。荷包牡丹碱作用于GABA-A受体的识别位点,选择性地阻断GABA-A受体。印防己毒素直接作用于Cl-通道,是GABA不可逆的阻断剂。GABA-B受体选择性激动剂有苯氨丁酸(baclofen)。其拮抗剂有5-amino valeric acid(5AVA),3-aminopropame sufonic acid(3APS)和phaclofen([4p-chlorophenyl]-3aminopropyl-phosphonic acid)]。GABA-C受体选择性激动剂有:TACA(trans-4-aminocrotonic acid), 蝇蕈醇,CACA(cis-4-aminocrotonic acid)[3]。拮抗剂有3APPA(3-aminoproyl phossphonic acid)。而kojic amone及progabode对GABA-A GABA-B受体均有激动作用。
2 GABA受体在脑缺血时的改变
采用离体细胞胞内和胞外记录技术测定GABA-A介导的快IPSP和GABA-B受体介导的慢IPSP发现,局灶性缺血28d后,由于抑制性中间神经元选择性的死亡及其轴索的消失,缺血组梗死灶部位GABA-A和GABA-B受体介导的抑制效应与对照组相比,分别降低了47%和37%[3]。而用免疫组化检测后发现,在紧邻皮层缺血损伤区1.7~4mm范围,GABA-A受体的a1亚型明显减少,而a2亚型无显著性改变。同时发现,在缺血损伤周边区约0.5~1.0mm范围,皮层的GABA能中间神经元parvalbumin的轴突和树突有萎缩现象,并且轴突和树突的数量减少[4]。电化学法导致的皮质缺血7天后,GABA-A受体的α1,α2,α5和γ2降低,而α3极显著上调。研究者认为,这种亚单元表达的差异性或许与脑卒中后的功能恢复有关[5]。在大鼠单侧永久性局灶性缺血4周后,在缺血区周边及对侧半球均可见GABA-A受体与 [3H]标记的蝇蕈醇(muscimol)结合显著降低,而与[3H]标记的安定(dizocilpine)结合增强[6]。Sommer C等人发现, 缺血后5min, 海马CA1区的GABA-A 受体与muscimol 的结合显著上调[7]。有报道发现:短暂性缺血后,在海马可见GABA-A受体mRNA的表达减少及GABA-A受体的迅速内化[8]。
3 GABA受体在脑缺血时的作用及可能机制
已有大量文献报道,缺血期间及缺血后,胞外抑制性氨基酸GABA和taurine是增加的。测定体内微透析收集到的样品时发现,缺血后GABA高达基础水平的(1060±143)%[9]。但是关于这些抑制性递质在脑缺血病理条件下的作用,特别是GABA受体的作用仍未达成共识。
3.1 神经保护作用
3.1.1 有助于神经元的存活和功能重建 免疫组化DAB染色后可观察到,在缺血损伤区约0.5~1.0mm范围,皮质的GABA能中间神经元parvabumim数量减少,其轴突、树突萎缩。因为缺血后,炎性细胞和巨噬细胞活跃, NO、自由基等毒性物质増加,引发一系列损伤效应和能量耗竭,综合效应的结果是细胞水肿、GABA能中间神经元受损,导致神经系统的抑制作用减弱[4]。大鼠经受大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO) 60min,在24h后给予muscimol,7~10d后将胚纹状体移植至受损纹状体,结果黑质部位的神经元与缺血对照组和缺血后单纯移植组相比有显著增多。病理行为学的测试结果也表明有显著好转,可见GABA受体激动剂有助于黑质神经元的存活和促进其功能重建。但是纹状体受损后,其他核团的中间神经元有否损伤,GABA受体激动剂能否通过轴突投射而有助于这些核团的中间神经元支配功能重建还有待阐明[10]。缺血后,CA1区神经元的AMPA受体和其配体的结合维持不变,但是[3H]musimol和GABA-A受体的结合明显上调,表面兴奋性和抑制性神经递质之间的相对变化有助于缺血后神经元的存活[11]。
3.1.2 与细胞内第二信使ATP和Ca2+的关系 使用传统的膜片钳全细胞记录技术发现,大鼠孤束核神经元的突触后GABA受体对GABA的亲和力是受到胞内[ATP]i调节的[12]。Harata等人以11~14d Wistar大鼠CA1区锥形神经元作材料,在维持胞内第二信使系统完整,同时维持Na+, K+ 和Cl-的浓度的情况下,采用nystatin-perforated膜片钳单通道记录发现,在缺乏ATP的情况下,正常神经元的GABA-A受体介导的内向Cl- 流-[IGABA]逐渐减少,而维持[ATP]i时,可阻断[IGABA]的降低。其原因是缺血时能量耗竭使[ATP]i减少,引起[IGABA]降低从而导致Ca2+重摄取增加,胞内Ca2+聚集。用5mmol/L的钙离子螯合剂EGTA可减轻Ca2+对GABA-A受体的影响[13]。有报道称,以蛙的背根神经节细胞为研究对象发现,Ca2+的增加抑制了GABA-A受体的活动[14]。这些研究结果表明,缺血引起GABA对突触GABA-A受体的反应因[ATP]i降低而减弱。由于缺血后GABA-A受体的功能受到抑制,从而剥夺了神经元发挥对抗兴奋性毒性的作用。联合给予NMDA受体阻断剂MK-801和GABA-A受体激动剂muscimol可以阻断缺血对大鼠大脑的损伤作用[15]。Schwartz-Bloom等人研究发现,成年大鼠海马的脑片在经受了7min的糖-氧剥夺后,ATP的水平降低了70% ,而diazepam(benzodiazepine受体的激动剂)能完全恢复此种状况。而且diazepam的作用可以被picrotoxin阻断,但benzodiazepine的拮抗剂flumazenil不能阻断diazepam的作用。细胞色素C的大量释放是受损细胞死亡的信号之一。Diazepam在使ATP水平完全恢复的同时还能阻止细胞色素C的释放[16]。
3.1.3 GABA受体的激动剂及其拟似物具有神经保护作用 采用生物鉴定法,在可逆性MCAO缺血模型上的研究发现,缺血5min后腹腔注射GABA-B激动剂baclofen 20mg/kg具有神经保护作用。由于baclofen可作用于突触前GABA-B受体,抑制glutamate的释放。同时,GABA-B受体在突触后膜发挥作用,增加钾导,限制了胞外Ca2+内流,这些作用减轻了随后的一系列损伤效应。但不能确定的是,baclofen引起血压升高并经过血管的侧支循环增加脑血流再灌是否是其发挥保护作用的原因之一。也就是说,其保护机制有待进一步探讨[17]。在沙鼠前脑缺血模型中发现,缺血前给予安定受体全效和部分激动剂diazepam和 PUN- 101017均可保护CA1区神经元的存活。但再灌后给予PUN- 101017的效用优于diazepam。可能的机制是,正常情况下GABA受体通过内向Cl-通道发挥去极化的抑制作用。但在缺血损伤时GABA受体因暴露在大量释出的GABA中转而产生兴奋效应。采用海马脑片研究发现,在GABA-A受体异常活跃时,不但使Cl-进入神经元,而且伴随阳离子以HCO3-形式进入[18]。结果内向Cl-流丧失而外向HCO3-持续存在,GABA反而使神经元去极化。因此,在缺血损伤前给予全效GABA激动剂能增强GABA的抑制作用,但在损伤后给予却不能发挥保护作用了[19]。在Schwartz-Bloom等人的研究里,前脑缺血后注射benzodiazepine受体的激动剂diazepam和部分激动剂imidazenil对海马CA1b区的神经元具有保护作用。分别采用Nissl染色和TUNEL染色观察发现,diazepam的治疗效果比imidazenil的好。但同时采用电镜方法,则可观察到CA1b区的神经细胞的超微结构已受到了破坏[20]。
有研究表明,GABA-A受体的拟似物clomethiazole对缺血损伤后的动物具有神经保护作用。但是人们没有肯定GABA-A受体的激动剂benzodiazepines 和部分激动剂 barbiturates 的神经保护作用。并且由于GABA-A受体亚型的多样性及其配体的作用而低估了GABA 拟似物的保护作用[21]。
3.2 GABA受体的神经毒作用 虽然通常认为缺血使兴奋性氨基酸增加,胞内Ga2+聚集,继而引发一系列反应,最后导致神经元死亡。但现有大量证据表明,兴奋性细胞死亡是胞外Cl-依赖性而非胞内Ga2+依赖性。据报道GABA和glycine受体的阻断剂具部分神经保护作用,这表明抑制性递质受体的活动导致兴奋性毒性[22]。Fukuda等人用7~14d的大鼠的体感皮质椎形神经元进行研究发现,GABA-A受体拮抗剂bicuculline可以减少缺血(糖-氧剥夺)引起的胞内Ca2+蓄积,但GABA不能引起胞内Ca2+的持续增加。当用1.5mmol/L furosenide(速尿)抑制了Cl-外排,则GABA能引起胞内Ca2+的增加。他们认为:GABA能神经元引起的IPSP比Glu引起的EPSP对缺血更为敏感。在正常情况下,GABA主要发挥抑制作用,bicuculline能通过阻抑GABA-A受体这一抑制体系而增加兴奋作用。但在缺血情况下Cl-外排机制受损,GABA-A致使膜去极化并引起Ca2+内流,此时的GABA扮演了加重兴奋性毒性的作用。由于未成熟个体 (7~14d的大鼠) 的大脑其抑制性和兴奋性体系之间的平衡尚未发育完全,因此GABA的抑制作用更易发生反转[23]。新生0d和1d的大鼠在外源性muscimol的作用下,海马齿状回的神经元减少,水迷宫实验发现,大鼠的学习能力缺损[24], 而且可以用dialtiazem(L-型电压敏感性Ca2+通道阻断剂)抑制[25]。Chen等人亦发现通过阻抑GABA 和glycine受体的活动,可以保护视网膜细胞免于缺血性损伤及死亡,因GABA 和Glycine受体的拮抗剂阻止了Cl-的内流[26]。Xu 等人发现, 缓慢抑制GABA-A受体的活动可以延长海马神经元的存活时间,而用神经类固醇或GABA-A受体的激动剂加强GABA-A受体的活动就会增加培养细胞的脱失,表明GABA-A受体的过度活动是具有神经毒作用的[27]。
综上所述,GABA受体的作用机制是复杂的,由不同亚单元组成的不同受体亚型,在缺血前和缺血时发挥的作用存在差异。不同受体亚型的不同作用途径, 以及在个体发育不同阶段的作用还需进一步阐明,以探索一条脑缺血保护的有效途径,并对临床用药提供正确的理论指导。
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