杨卉,陈生弟,李彪,陆国强
(上海第二医科大学附属瑞金医院神经科、帕金森病诊疗与研究中心,上海 200025)
摘要:目的 克隆人野生型parkin基因并构建真核表达载体pCDNA3.1-parkin,将重组质粒转染PC12细胞获得高表达人野生型parkin基因的PC12细胞克隆。方法 从胎脑组织中提取总RNA,用RT-PCR方法获得人野生型parkin基因的全长cDNA,插入pCR2.1-TA克隆载体中进行序列测定,测序正确后将其亚克隆至表达载体pCDNA3.1,利用脂质体将重组质粒转染PC12细胞,经G418筛选获得抗性细胞克隆,采用RT-PCR和Western Blot方法鉴定人野生型parkin基因在PC12细胞中的过表达。结果 经限制性内切酶酶切图谱分析和DNA序列测定证实目的基因已插入重组质粒,RT-PCR和Western Blot证明经G418筛选得到的转基因PC12细胞克隆中存在人野生型parkin基因的表达。结论 成功构建了人野生型parkin基因的真核表达载体,获得了稳定表达人野生型parkin基因的PC12细胞克隆,为进一步研究parkin的生物学功能以及parkin在帕金森病发病机制中的作用奠定了良好的基础。
关键词:parkin基因;质粒;PC12细胞;帕金森病
中图分类号:Q 文献标识码:
Construction of eukaryotic expression vector containing human wild-type parkin gene and its expression in PC12 cells
YANG Hui, CHEN Sheng-di, LI Biao, LU Guo-qiang
(Department of Neurology, Clinical & Research Center for Parkinson Disease, Ruijin Hospital, Shanghai Second Medical University, Shanghai 200025, China)
Abstract: Objective To clone human wild-type parkin cDNA, construct its eukaryotic expression vector and obtain positive PC12 cell clones expressing human wild-type parkin gene stably. Methods The total RNA was extracted from aborted fetal brain. The full-length cDNA encoding human wild-type parkin gene was obtained using RT-PCR method and inserted into pCR2.1-TA cloning vector. After the sequencing was confirmed, the gene
基金项目:脑功能和脑重大疾病的基础研究――帕金森病的发病机制和防治基础资助项目(G1999054008);国家自然科学基金(39970263, 30171025)资助项目;上海市卫生系统百名跨世纪优秀学科带头人培养计划(97BR001)资助项目
通讯作者:陈生弟 作者简介:杨卉(1975-),女,在读博士生,主要从事帕金森病发病机制的分子生物学研究
E-mail: chen_sd@medmail.com.cn 联系电话:021-64370045-665514 收稿日期:2003-09-01
was subcloned to pCDNA3.1 to construct recombinant eukaryotic expression vector pCDNA3.1-parkin. The recombinant plasmid was transfected into PC12 cells by lipofectamin method and positive cell clones were screened with G418. Overexpression of human wild-type parkin gene in the transfected cells was confirmed with RT-PCR and Western Blot. Results Enzyme digestion analysis and sequencing showed that the target gene was cloned into recombinant vector. Overexpression of human parkin gene in the transfected PC12 cells was identified with RT-PCR and Western Blot. Conclusion The eukaryotic expression plasmid containing human parkin gene was successfully constructed. The positive PC12 cell clones expressing human wild-type parkin gene stably were obtained, which may be a promising cell model for studying the biological function of the parkin gene and the role of parkin in the pathogenesis of Parkinson disease.
Keyword parkin gene; plasmid; PC12 cell; Parkinson disease
Parkin基因是1998年由Kitada等发现并命名的常染色体隐性遗传性青少年型帕金森综合征(AR-JP)的致病基因,定位于6q25.2-27[1]。自克隆成功以来先后在多个国家的AR-JP家系中发现了parkin基因的几十种不同突变。多项研究显示早发性散发性帕金森病患者中也存在parkin的多种突变;这提示parkin基因很可能在遗传性帕金森病和原发性帕金森病的共同致病机制中发挥关键作用。
目前,parkin的功能研究取得了初步进展,但其确切的生物学作用仍不清楚。2000年Shimura等首先报道parkin蛋白是一种环形泛素蛋白连接酶,在泛素蛋白酶体通路中担负特异性识别靶蛋白的重要职责,参与细胞内蛋白质的降解过程,在细胞内蛋白质的质量控制过程中发挥重要作用[2]。至今已发现的5种parkin蛋白底物,如CDCrel-1,Synphilin-1,αSP22,Pael-R和Cyclin E,提示parkin可能参与突触囊泡转运、内质网应激和细胞凋亡等生物学过程[3]。有些学者推测:帕金森病患者发生parkin基因突变,致使parkin蛋白丧失泛素蛋白连接酶活性,可能造成细胞内有害蛋白质的异常堆积,最终导致多巴胺能细胞死亡;parkin蛋白可能具有细胞保护作用,通过泛素蛋白酶体通路来抑制某种或某些类型的细胞死亡。
由此可见,深入研究parkin基因的功能对于阐明遗传性和原发性帕金森病的发病机制以及寻求新的帕金森病治疗策略都有重要意义。本研究从胎脑组织中克隆得到了人野生型parkin基因,成功构建了parkin基因的真核表达载体,并获得稳定表达人parkin基因的PC12细胞克隆,为下一步研究parkin的生物学功能以及parkin在帕金森病发病机制中的作用奠定了良好的基础。
1 材料与方法
1.1 材料 正常人脑组织标本来源于流产胎儿脑组织;质粒pCDNA3.1和大肠杆菌DH5α为本实验室保存;PC12细胞购自中科院上海生物化学和细胞生物学研究所;pCR2.1 TA Vector,OPTI-MEMâI,Lipofectamin2000,Trizol和DMEM培养液均为Invitrogen公司产品;M-MLV逆转录酶,Taq酶购自Promega公司;Advantage cDNA PCR Kit购自Clontech公司;连接酶、限制性内切酶和DL2000 Marker购自Takara公司;胶纯化试剂盒购自QIAGEN公司;兔抗人parkin多克隆抗体和HRP标记小鼠抗兔IgG为Cell Signaling公司产品;兔抗鼠Actin多克隆抗体购自Santa Cruz公司;考马氏亮蓝法总蛋白检测试剂盒购自南京建成生物公司。
1.2 方法
1.2.1 RT-PCR扩增人野生型parkin基因的全长cDNA 用Trizol试剂从胎脑组织中抽提总RNA,取1μg RNA作为逆转录模板行RT反应。采用具有纠错功能的可扩增长片段cDNA模板的Advantage cDNA Kit试剂盒进行PCR反应。上游引物:5’-cccagtgaccatgatagtgtttgt-3’,下游引物:5’-ttcttctgcaatttggctgtagtt-3’;PCR反应条件为:94℃预变性5min;94℃变性1min,62℃退火1min,72℃延伸2min,循环35次;最后72℃延伸10min。PCR产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳进行初步鉴定。
1.2.2 克隆载体pCR2.1-parkin的构建和序列测定 TA克隆载体pCR2.1与胶回收纯化的PCR产物按1:3(摩尔比)的比例在T4 DNA连接酶作用下进行连接,16℃反应16h。取10µl连接反应液转化DH5α感受态细菌,将转化的菌液涂在X-gal处理过的含有氨苄青霉素的LB平板上培养12h,在长出蓝、白克隆的LB平板上挑取白色克隆进行少量扩增、质粒小抽,用EcoRI单酶切初步鉴定阳性细菌克隆,将酶切鉴定正确的细菌克隆送交上海申友公司测序。
1.2.3 真核表达载体pCDNA3.1-parkin的构建和鉴定 测序正确的质粒pCR2.1-parkin用限制酶HindIII和XbaI进行双酶切反应,纯化回收约1.4Kb大小的目的片段;质粒pCDNA3.1也进行HindIII和XbaI双酶切,纯化回收大片段。用T4 DNA连接酶连接目的片段和线性化的空质粒pCDNA3.1,16℃反应16h。转化DH5α感受态细菌,将转化的菌液涂在含有氨苄青霉素的LB平板上培养12h,挑取阳性克隆进行少量扩增、质粒小抽,以HindIII和XbaI双酶切鉴定阳性细菌克隆。
1.2.4 重组质粒pCDNA3.1-parkin在PC12细胞中的表达 PC12细胞采用含10%胎牛血清、100IU/ml青霉素和100IU/ml链霉素的DMEM高糖培养液,置于37℃的CO2培养箱中培养。转染前将PC12细胞按照5×105/孔的密度铺于六6孔板(Falcon)中,待细胞生长达80%融合度时吸出培养液,用磷酸缓冲液(PBS)清洗2次,加入OPTI-MEMâI培养液500µl,将1µg DNA和250µlOPTI-MEMâI混合,3µl Lipofectamine2000和250µlOPTI-MEMâI混合,5 min后将两液混合,室温静止25 min后加入培养孔,37℃转染5 h后更换为正常PC12培液,37℃的5%CO2培养箱继续培养72h,然后用96孔有限稀释法进行G418(500µg/ml)抗性细胞克隆的筛选。
1.2.5 RT-PCR和Western Blot鉴定人parkin基因在PC12细胞中的稳定表达 待具有G418抗性的PC12细胞克隆长满6孔板时,抽提细胞总RNA进行RT-PCR反应,鉴定人parkin基因的表达,引物序列与反应条件同上。同时,抽提细胞总蛋白质,用考马氏亮蓝法测定样品蛋白浓度,取10µg总蛋白行10%SDS-PAGE蛋白电泳(100V,20min;然后150V,2h);蛋白转膜(80mA,2h)后进行Western Blot检测,反应条件:①PVDF膜浸于封闭液中,4℃过夜;②加入兔抗人parkin多克隆抗体(1:1000)或兔抗鼠Actin多克隆抗体(1:200),室温振荡孵育4h;清洗后加入HRP标记的小鼠抗兔IgG(1:2,000),室温振荡孵育1h;③采用化学发光法检测,9ml去离子水中加入ECL(enhanced chemicoilluminenscenecs)溶液A和溶液B各0.5ml,充分混匀后加在膜上,暗室曝光X线底片10min。
2 结果
2.1 特异性条带的获得 RT-PCR产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳分离后得到一条约1.4kb的特异条带,符合parkin cDNA的大小。
2.2 重组克隆载体pCR2.1-parkin的酶切鉴定及测序分析 质粒pCR2.1的多克隆位点区(MCS)有两个EcoRI限制酶位点;重组克隆载体pCR2.1-parkin经EcoRI单酶切后得到一条1.4kb的目的条带和一条约3.9kb的线性化质粒pCR2.1的条带。单酶切鉴定正确的pCR2.1-parkin细菌克隆进行测序,测序结果与Gene bank登录序列(AB009973)进行Blast序列比对,结果显示除第768位碱基由“C”变为“T”(即第223位氨基酸由“脯氨酸”变为“丝氨酸”)以外,其余碱基序列完全一致(Fig 2)。经考证发现大多数健康人的parkin基因第768位碱基为“T”(即第223位氨基酸为“丝氨酸”),它是野生型碱基类型,并非突变型,证明本研究已正确克隆了人野生型parkin基因的cDNA序列。
Fig 2 Blast sequence analysis of human parkin gene.Query:The sequence of human wild-type parkin gene in Gene bank (AB009973);Sbjct: The sequencing result of the recombinant plasmid pCR2.1-parkin
Query: 752 ctctgacaaggaaacaccagtagctttgcacctgatcgcaacaaatagtcggaacatcac 811
|||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct: 738 ctctgacaaggaaacatcagtagctttgcacctgatcgcaacaaatagtcggaacatcac 797
Query: 812 ttgcattacgtgcacagacgtcaggagccccgtcctggttttccagtgcaactcccgcca 871
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct: 798 ttgcattacgtgcacagacgtcaggagccccgtcctggttttccagtgcaactcccgcca 857
2.3 重组表达载体pCDNA3.1-parkin的构建和酶切鉴定 重组质粒用限制酶HindIII/XbaI双酶切,电泳结果显示约1.4kb处有一特异条带,证明目的基因已正确插入质粒pCDNA3.1,得到了真核表达载体pCDNA3.1-parkin(Fig 3)。
2.4 RT-PCR鉴定人parkin基因在PC12细胞中的稳定表达 重组质粒pCDNA3.1-parkin转染后经G418(500µg/ml)筛选得到G418抗性细胞克隆,抽提细胞总RNA行逆转录反应,采用特异性扩增人源性parkin基因的上、下游引物进行PCR反应,得到了人parkin基因的目的条带(1.4kb),提示G418抗性细胞克隆中存在人parkin基因。空质粒pCDNA3.1转染后获得的G418抗性细胞克隆经RT-PCR后无特异性条带生成(Fig 4)。
2.5 Western Blot鉴定人parkin基因在PC12细胞中的稳定表达 转染质粒pCDNA3.1-parkin的PC12细胞克隆经Western Blot证实约52KkD处有高表达的parkin蛋白条带,提示人parkin基因已经在PC12细胞中获得了稳定表达;转染空质粒的PC12细胞克隆和未转染质粒的PC12细胞中仅有低水平内源性parkin蛋白表达(Fig 5)。
3. 讨论
Parkin基因是继α-synuclein后第二个被克隆的家族性帕金森病的致病基因,编码一种分子量(Mr)约为52000,具有独特的泛素样结构域和双环指样结构域的高度保守蛋白质,即parkin蛋白。像其他拥有环指样结构的许多蛋白质一样,parkin蛋白被证实是一种环形泛素蛋白连接酶,参与细胞内突变、损伤和错误折叠蛋白质的清除过程。研究发现AR-JP患者所有脑区均无parkin蛋白分布,parkin基因突变使parkin蛋白丧失了泛素蛋白连接酶活性[4]。目前,parkin功能缺失阻断泛素蛋白酶体通路后如何损伤多巴胺能神经元的机制尚不清楚。近期研究显示离体培养神经元中parkin突变表达能增强氧化应激和增加一氧化氮生成[5]。海藻酸诱导人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y凋亡时parkin蛋白在caspase酶介导下被水解清除,说明parkin功能下调可能在凋亡途径中发挥作用[6]。突触囊泡相关蛋白CDCrel-1是一种parkin蛋白底物,在神经系统优势表达,可抑制突触囊泡分泌;CDCrel-1异常积聚可能会抑制多巴胺分泌引起多巴胺能细胞氧化损伤[7]。由此可见,parkin基因可能通过参与多种细胞过程(如凋亡,神经递质转运,氧化应激,内质网应激等)中相关蛋白质的降解过程发挥重要功能;parkin功能缺失可能引起细胞内这些有害蛋白质异常堆积,最终导致多巴胺能神经元变性死亡。令人欣喜的是,最近有三项研究报告证实parkin基因的过表达具有多重保护作用,能保护神经元免遭α-synuclein毒性,蛋白酶体抑制剂,Pael-R积聚以及海藻酸诱导的兴奋性毒性所造成的多种形式的损伤,这为将来通过降解细胞内有害蛋白质沉积防治帕金森病提供了直接而有力的实验依据[8~10]。进一步研究parkin基因功能有助于阐明帕金森病的发病机制和发现新的帕金森病治疗思路。
本实验中构建的重组质粒限制性内切酶酶切图谱与预期结果相符,获得了约1.4kb大小的目的条带。将目的基因测序结果与Gene bank中登录序列进行比对,我们发现测序结果除第768位碱基由“C”变为“T”(即第223位氨基酸由“脯氨酸”变为“丝氨酸”)以外,其余碱基序列完全一致。早在1998年公布发现parkin基因的论文中,Kitada等就曾指出,所有受试个体(包括患者和正常对照者)的parkin DNA序列与已登录的cDNA序列相比,第768位碱基不是“C” 而是 “T”,即第223位氨基酸不是“脯氨酸”而是“丝氨酸” [1]。此后,该研究小组发现大多数的日本人,土耳其人和高加索人parkin基因的第223位氨基酸是 “丝氨酸”,证实 第223位“丝氨酸”是野生型。因此,本实验中克隆的人野生型parkin cDNA序列是完全正确的。我们在实验中采用特异性扩增人源性parkin基因的上、下游引物通过RT-PCR反应鉴定外源性人parkin基因在转基因PC12细胞中的表达,证实了具有G418抗性的转染重组质粒pCDNA3.1-parkin的PC12细胞克隆中有人parkin基因的mRNA水平的表达;同时,我们对这些转基因细胞进行了Western Blot检测,发现约52kD处有高表达的parkin蛋白条带,说明这些细胞中有人parkin蛋白的高水平表达。本实验中我们成功获得了稳定转染人野生型parkin基因的PC12细胞克隆,这为我们进一步研究parkin基因功能和parkin基因在帕金森病发病机制中的作用以及parkin蛋白可能的神经保护作用打下了良好的实验基础。
参考文献:
[1] Kitada T, Asakawa S, Hattori N, et al. Mutation in the parkin gene cause autosomal recessive juvenile parkinsonism[J]. Nature, 1998, 392: 605-608.
[2] Shimura H, Hattori N, Kubo S, et al. Familial Parkinson disease gene product, parkin, is a ubiquitin-protein ligase[J]. Nat Genet, 2000, 25: 302-305.
[3] Feany MB, Pallanck LJ. Parkin: a multipurpose neuroprotective agent[J]. Neuron, 2003, 38: 13-16.
[4] Shimura H, Hattori N, Kubo S, et al. Immunohischemical and subcellular localization of Parkin: absence of protein in AR-JP[J]. Ann Neurol, 1999, 45: 668-672.
[5] Hyun DH, Lee M, Hattori N, et al. Effect of wild-type or mutant Parkin on oxidative damage, nitric oxide, antioxidant defenses, and the proteasome[J]. J Biol Chem, 2002, 277: 28572-28577.
[6] Kahns S, Lykkebo S, Jakobsen LD, et al. Caspase-mediated parkin cleavage in apoptotic cell death[J]. J Biol Chem, 2002, 277: 15303-15308.
[7] Zhang Y, Gao J, Chung KK, et al. Parkin function as an E2-deprndent ubiquitin-protein ligase and promotes the degradation of the synaptic vesicle-associated protein, CDCrel-1[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2000, 21: 13354-13359.
[8] Petrucelli L, O'Farrell C, Lockhart PJ, et al. Parkin protects against the toxicity associated with mutant alpha-synuclein: proteasome dysfunction selectively affects catecholaminergic neurons[J]. Neuron, 2002, 36: 1007-1019.
[9] Yang Y, Nishimura I, Imai Y, et al. Parkin suppresses dopaminergic neuron-selective neurotoxicity induced by Pael-R in Drosophila[J]. Neuron, 2003, 37: 911-924.
[10] Staropoli JF, McDermott C, Martinat C, et al. Parkin is a component of an SCF-like ubiquitin ligase complex and protects postmitotic neurons from kainate excitotoxicity[J]. Neuron, 2003, 37: 735-749.