唐治华1, 刘国卿2
(1.南京军区军事医学研究所,江苏南京210002;2.中国药科大学药理学教研室,江苏 南京210009)
摘要: 目的 分离不含神经组织的高纯度脑微血管片段并研究其GABA转运体的亚型分布。方法 采用磁珠在体动脉灌注标记大鼠脑血管,机械和胶原酶消化相结合解离脑组织技术,经过筛去除大血管后,在磁场下分选出脑微血管片段。应用RT-PCR技术分析神经元特异表达基因microtubule-associated protein(MAP-2a)、胶质细胞特异表达基因glatamine synthetase、血管内皮细胞特异表达基因CD31及4种已发现的GABA转运体亚型基因的表达,克隆微血管片段表达的GABA转运体亚型基因并测序确证。结果 分离的脑微血管片段没有发现明显的神经组织附着;也没有检测到神经元和胶质细胞特异表达的mRNA。在该脑微血管片段检测到1种低亲和力的GABA转运体BGT-1和1种高亲和力的转运体GAT-2。结论 磁选获得的脑微血管片段适用于血脑屏障上转运体基因的检测与克隆研究。大鼠血脑屏障上存在GAT-2和BGT-1两种GABA转运体亚型。本研究没有在血脑屏障发现其他已报道的GABA转运体,是否存在新的GABA转运体,尚需进一步研究探讨。
关键词:血脑屏障,GABA,转运体
中图分类号:Q781 文献标识码:A
Locolization of GABA transporter subtypes at the blood-brain barrier
TANG Zhi-hua1, LIU Guo-qing2
(1.Nanjing Military Medical Institute, Nanjing 210002; 2.Chinese Pharmaceutical University,Nanjing 210009)
Abstract: Objective To isolate the brain microvessels without neural tissues and investigate the locolization of GABA transporter subtypes at blood-brain barrier. Methods The brain microvessels labelled by intracarotid infusion of magnetic beads were obtained by magnetic sorting,and their neural specific gene microtubule-associated protein 2a(MAP-2a), glial specific gene glatamine synthetase,microvascular endothelial cell specific gene CD31 and GABA transporter subtypes were analysed by RT-PCR.The gene of GABA transporter subtypes expressed in the brain microvessels were cloned and sequenced. Results In the isolated
brain microvessels the neural specific gene, glial specific gene were not detected,and microvascular endothelial
基金项目:国家自然科学基金项目(30171075) 通讯作者:唐治华 作者简介:唐治华(1966-),男,河南睢县人,副研究员,中国药科大学在读博士生,主要从事药理毒理学研究. E-mail:Tangzhjn@yahoo.com.cn 联系电话:(025)4500460 收稿日期:2003-09-28
cell specific gene,GAT-2 and BGT-1 of GABA transporter were found . Conclusion The brain microvessels obtained by magnetic sorting were convenient for detecting and cloning specific gene at the blood-brain barrier.GAT-2,BGT-1 of GABA transporter subtypes were detected at blood-brain barrier and responsible for the GABA effluxing from the brain.
Key words: blood-brain barrier; GABA; transporter
γ-氨基丁酸(GABA)是哺乳动物脑内主要的抑制性神经递质。GABA转运体能摄取突触间隙及细胞外液的GABA,终止神经冲动传递,与生理病理过程关系密切。GABA转运体属Na+,Cl-依赖性神经递质转运体家族[1]。目前4种大鼠GABA转运体亚型已被克隆,根据其氨基酸序列和药理学特性分为GAT1,GAT2,GAT3和BGT-1。GAT1和GAT3仅在神经系统表达 ,而GAT2和BGT-1还在肝、肾等其他器官被检测到,GAT1,GAT2,GAT3属高亲和力转运体,BGT-1属低亲和力转运体[2]。
血脑屏障主要由紧密连接的脑毛细血管内皮细胞构成,它不仅调控循环血液中的营养物质和药物进入脑内,而且可将神经递质和神经活性甾体外排入循环血液。我们曾采用牛脑微血管和培养的牛脑微血管内皮细胞研究血脑屏障的GABA转运,发现血脑屏障上存在低亲和力和高亲和力2种GABA转运体;受4种GABA转运体抑制剂抑制的强弱顺序分别接近BGT-1和GAT-1,但又不完全相同;血脑屏障上GABA的净转运方向是从脑到血 [3,4]。Kakee等[5,6]用脑外排指数法进一步证实了血脑屏障对GABA的外排转运,并在永生化的小鼠脑毛细血管内皮细胞株(TM-BBB)证实存在BGT-1的mRNA和蛋白质的表达。原代培养的内皮细胞或细胞株常在长期传代过程中不同程度地丧失或改变了在体的生物学活性[7],应用培养细胞研究血脑屏障的转运体基因分布具有一定的局限性。血脑屏障上的GABA转运体可能成为药物作用的新靶点,具有较高的理论意义和实用价值。为此,我们采用磁珠分选的高纯度脑微血管和RT-PCR技术研究血脑屏障上GABA转运体,以期进一步明确其亚型分布。
1 材料与方法
1.1 动物 SD大鼠,体重250~300g,雌雄不拘,南京中医药大学实验动物中心提供。
1.2 磁珠 采用液相合成法制备铁氧体磁珠,经分级分离得到200~500nm的球形磁珠[15]。磁珠悬于生理缓冲液中,浓度为10mg/ml。
1.3 磁珠灌注及脑微血管分离[8] 硫喷妥钠40mg/kg腹腔注射麻醉。分离两侧颈内动脉并插管,经插管注入肝素200IU/kg使全身肝素化。双侧插管内分别同时注入磁珠4ml/kg。断头处死大鼠,取出两侧大脑半球,剔除软脑膜及白质,剪碎,悬于pH7.2的PBS缓冲液,与0.1mg/ml的胶原酶Ⅱ型等比例混合,置37℃消化30min后,吹打至无明显团块。将组织悬液通过100目的筛网,收集的滤液置试管中,在2000GS磁场下磁选5min,将贴壁的微血管片段用PBS缓冲液悬起,重复磁选1次。
1.4 大鼠脑微血管片段的分子生物学鉴定[ 9 ] 用Tripure试剂(Roche)分别抽提微血管片段和全脑组织的tRNA,作为RT-PCR反应的模板。设计合成神经元特异表达基因微管相关蛋白2a(microtubule-associated protein 2a,MAP-2a)的引物5ˊ- CTAGATCCACTAATGCCAGT -3ˊ和5ˊ-GTGATCCTCTTGTCCAC-3ˊ, 扩增片段为640bp;胶质细胞特异表达基因谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase)的引物5ˊ-CTAGATCCACTAATGCCAGT-3ˊ和5ˊ-TTAGCACACCAGTCTTGAAC-3ˊ,扩增片段为500bp;血管内皮细胞特异表达基因CD31的引物5ˊ-GCCTTGGTAGAGCACA-3ˊ和5ˊ-GCCTTGGCTTTCCTCA-3ˊ,扩增片段为1007bp。采用上述模板、引物和Access RT-PCR System(Promega)进行RT-PCR。反应条件为:42℃ 60min,94℃ 5min 1个循环;94℃30s,退火1min,72℃1min,共30个循环;72℃延伸7min。MAP-2a,谷氨酰胺合成酶和CD31的退火温度分别为50℃,50℃和41℃。采用1.2%琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物。
1.5 RT-PCR分析血脑屏障上GABA转运体的亚型分布 采用Clustalw软件对大鼠GAT1,GAT2,GAT3和BGT-1的cDNA全序列进行同源性分析,取高度保守片段5’-ATCTTCTCCATCGTGGGCTTCAT-3’作为其共同的上游引物,取相对特异性片段分别作为其下游引物,GAT1为5’-AATGCCACCCTGGGTGATG-3’,GAT2为5’-为CCATGGATATGTGTACTTC-3’,GAT3为CTCCCTCTGTCAGCATCACC,BGT-1为5’-AGAGCCAGGAGATCTTCAC-3’。分别以抽提的脑微血管片段和全脑组织的tRNA为模板,进行RT-PCR。反应体系50μl,包括:5×AMV/Tfl缓冲液10μl, AMV逆转录酶5U,Tfl DNA多聚酶5U,10mmol/L dNTPs 1μl,25mmol/L MgSO41.5μl,正义引物和反义引物均为50pmol,tRNA 5μg,加DEPC处理水补至50μl。反应条件为:42℃ 60min,94℃ 5min 1个循环;94℃30s,退火1min,72℃1min,共30个循环;72℃延伸7min。GAT1、GAT2、GAT3和BGT-1的退火温度分别为52℃,53℃,47℃和50℃。采用1.2%琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物。
1.6 PCR产物的分离纯化、克隆和测序 用无菌刀片切取含微血管片段GABA转运体特异DNA片段条带的凝胶,采用Wizard PCR Preps DNA Purification System(Promega)回收纯化DNA片段,以pGEM—T Vector System Ⅱ(Promega)克隆DNA片段。挑取白色菌落,送上海申友生物技术公司测序。
2结果
2.1 大鼠脑微血管片段的分子生物学鉴定 分离纯化的大鼠脑微血管片段在相差显微镜下为直径7μm左右的微血管片段,呈树状逐级分支,无神经组织附着。MAP-2a,glutamine synthetase和CD31基因的RT-PCR反应产物经1.2%的琼脂糖凝胶电泳,溴化已錠染色分析,全脑组织中MAP-2a,glutamine synthetase和CD31均在相应位置出现阳性条带,分离纯化的脑微血管仅CD31阳性(Fig 1)。以上操作重复2次,电泳结果均与第一次完全一致。
2.2 大鼠脑微血管片段的GABA转运体基因亚型分布 分别采用4种GABA转运体对应的特异引物和共同的上游引物,以纯化大鼠脑微血管和脑组织的tRNA为模板,进行RT-PCR。RT-PCR反应产物经1.2%的琼脂糖凝胶电泳,溴化已錠染色分析,全脑组织GAT1, GAT2, GAT3, BGT-1均在相应位置出现阳性条带,分离纯化的脑微血管中仅GAT2, BGT-1阳性()。
对脑微血管片段的GAT2和BGT-1的阳性条带进行克隆、测序,分别得到491bp和414bp的两段核苷酸序列。同源性分析结果表明,它们分别与大鼠GAT2(GenBank M95762),BGT-1(GenBank L42300) cDNA全序列的对应部分高度同源,同源性均为99%。
3 讨论
利用磁选分离的原理,我们采用直径小于红细胞的球形磁性材料于体内颈动脉灌注标记脑血管,机械和胶原酶消化相结合解离脑组织,最大限度地保持了游离出的微血管内皮细胞的完整性。经过筛去除大血管后,在磁场下分选得到了脑微血管片段。形态学观察表明该微血管片段没有明显的神经组织附着;也没有检测到神经元和胶质细胞特异表达的mRNA,排除了完整神经元和胶质细胞成分的存在。
血脑屏障的主要功能是限制循环血液中的疏水性物质非特异性地进入脑组织液,同时保留脑内的神经递质。目前认为其另一重要作用是作为脑的解毒系统外排内源性代谢产物。近年的研究证实,血脑屏障上存在多种神经递质转运体如去甲肾上腺素,5-羟色胺[10],谷氨酸[11]和GABA转运体等,它们不同程度地参与了神经递质的外排转运和灭活。但这些转运体在神经递质灭活中的作用和其真正意义有待探讨。
本研究结果证实有1种低亲和力的GABA转运体BGT-1和1种高亲和力的转运体GAT-2共同存在于大鼠脑微血管,而在永生化小鼠脑毛细血管内皮细胞株仅发现BGT-1的分布[6]。与我们的前期研究结果相对照[3],BGT-1可能就是存在于脑微血管内皮细胞腔面的低亲和力转运体,担负GABA的内排转运。Ohtsuki等[12]仅在培养内皮细胞发现BGT-1一种GABA转运体,故认为血脑屏障对GABA的外排转运是由BGT-1所介导。GAT-2可能存在于脑面,参与了血脑屏障GABA的部分外排转运。这样,GABA的净转运方向就是从脑到血,该推断与前期研究结果相符合。但GAT-2对GABA外排转运的强度和数量取决于其在血脑屏障上分布的区域和密度。
脑内GABA转运体的主要功能是快速重摄取突触间隙的GABA以终止其突触传递。血脑屏障对GABA的净转运方向是由脑到血,这已被不同实验室所证实[4,6]。血脑屏障对GABA的外排转运功能与脑内GABA转运存在一定差异。GAT-2可能参与脑脊液GABA水平的调节,进而间接调节GABA能传导; GAT-2介导的GABA转运也可能在渗透压调节中发挥一定作用[12]。小分子有机质牛磺酸(taurine),甜菜碱(betaine)和肌醇是脑内重要的渗透介质[13]。在高张状态下,如taurine,betaine在脑内浓度升高,外排转运是渗透压调控的主要方式。Betaine,taurine 及hypotaurine对GAT2均具有较高的亲和性,血脑屏障上的GAT2对GABA和小分子有机质的外排转运作用可能是调节脑渗透压的重要方式。血脑屏障上的GABA转运体可能不参与正常情况下突触间隙GABA的快速灭活。进一步研究GAT-2在血脑屏障上的分布特点有助于阐明其在血脑屏障GABA转运中的作用。
本实验结果表明,磁选获得的脑微血管片段适用于血脑屏障上转运体基因的检测与克隆研究。大鼠血脑屏障上存在GAT-2,BGT-1两种GABA转运体亚型。本研究没有在血脑屏障发现其他已报道的GABA转运体,是否还存在其他的GABA转运体,尚需进一步研究探讨。
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