韩忠朝 冯四洲 韩明哲
造血干细胞(HSC)移植技术主要包括干细胞的鉴别，活性测定，干细胞的采集，分离纯化，动员，扩增，干细胞保存，肿瘤细胞的净化，干细胞改造以及干细胞操作专用仪器、材料和试剂的开发生产等。
1 HSC特征 HSC在体内多数处于G０期或休眠期，而祖细胞则比较活跃，在多种细胞因子或生长因子作用下能大量增殖与分化。HSC可以通过单克隆抗体检测确定其存在。研究发现CD34＋细胞群中，90%以上的细胞为祖细胞，更原始细胞具有CD33-、CD38-、HLA-DR-、Thy-1＋(low)、c-kit＋(low)、Rh-123淡染或不染色，能耐受5-氟尿嘧啶的作用等特点。CD34＋细胞约占正常骨髓单个核细胞(MNC)的1.5%，多能造血干细胞约占骨髓MNC十万分之一，形态学无法鉴别。
2 不同来源干细胞的特点 HSC主要来源于骨髓、成人外周血、脐血。脐血有如下特点：造血干细胞含量丰富，虽然CD34＋细胞数低于骨髓，但CD34＋CD38-细胞数高于骨髓，且脐血CD34＋CD38-细胞增殖分化能力高于骨髓，尤其是加入各种细胞因子后CFU-GEMM、BFU-E集落数明显高于骨髓［1，2］；研究端粒时发现随着年龄增长，其长度逐渐减少，每一次细胞分裂约丢失50个碱基对，纯化的成人CD34＋CD38low和CD34＋CD71lowCD45Ralow细胞端粒较脐血及胎肝细胞短，因此认为脐血为具有很强增殖潜能的造血组织［3］；淋巴系统抗原表达弱，淋巴细胞功能不成熟，这显示出脐血干细胞移植(UCBT)后移植物抗宿主病(GVHD)的发生率可能较低［3］；有研究者报告，-196℃直接冻存脐血6个月以上，HPP-CFC、CFU-GEMM、BFU-E、CFU-GM回收率为80%～87%，经分离的MNC冻存后长期培养起始细胞(LTC-IC)、CFU-GEMM、BFU-E、CFU-GM回收率为82%～91%［4］。Broxemeyer等［5］研究表明冻存10年的脐血HSC仍具有良好的回收率，这提示建脐血库的可能性。 正常状态下，外周血中的干/祖细胞含量占MNC的0.01%～0.1%，相当于骨髓的1%～10%，动员出的外周血MNC中CD34＋细胞数及CFU-GM数均明显高于骨髓。以上研究提示脐血、外周血干细胞(PBSC)是骨髓移植的良好替代物。
3 PBSC动员和采集 PBSC动员的方式有三种，即大剂量化疗、单用造血生长因子(HGF)和二者合用，异体供者单用HGF动员，肿瘤患者则采用大剂量化疗和(或)HGF。HGF较常用的是G-CSF或GM-CSF，G-CSF效果优于GM-CSF，后者副作用明显多于前者；Hoglund等［6］研究发现糖基化的G-CSF动员CD34＋细胞峰值数明显高于非糖基化的G-CSF。大剂量化疗多采用环磷酰胺(CTX)4～7g/m２静滴，可使外周血CFU-GM提高50倍以上，化疗与HGF合用可使CFU-GM提高百倍以上，最高可达1000倍左右。临床及实验研究发现，IL-1、IL-3、IL-6、IL-11、Epo、SCF、PIXY321、MIP-1α虽也有动员作用，但单用效果不佳，一般两个或两个以上HGF联合或与化疗联用效果较好；IL-8动员作用尤其快速；最具有吸引的是Flt3配体可能具有良好的动员作用，有研究表明单用Flt3配体9天即可使鼠外周血CFU-GM增加83倍，与G-CSF合用增加2?193倍，用鼠PBSC移植后能长期稳定造血［7］。有关外周血干细胞动员的机制尚不清楚，可能与化疗及细胞因子对骨髓微环境和HSC生物学功能(粘附能力、通透性)的改变有关。PBSC的采集采用CS 3?000或Cobe Spectra分离MNC，前者启动后形成稳定白细胞层所需时间明显较短，而收集CD34＋细胞及MNC的效率明显高于后者［8］。
4 HSC的纯化与保存 可用活化细胞分选术、免疫磁珠、免疫亲和柱等方法富集CD34＋HLA-DR-、CD34＋CD33- HLA-DR-、CD34＋CD38-Lin-、CD34＋Thy＋Lin-等早期干/祖细胞。干细胞纯化具有净化自体移植物、提高干细胞体外扩增及基因转导的效率、减少异体移植(尤其是2～3个位点不合的异体移植)GVHD及移植排斥的发生等作用，对于难治性自身免疫性疾病可经干细胞纯化除去异常免疫细胞后行自体移植。
HSC可以采用程控降温 (-196℃液氮保存) 及 -80℃长期保存，两种方法均有良好的回收率，尤其是 -80℃保存简单易行适合于我国基层单位。4℃保存HSC只适合于72小时内移植用。
5 造血干细胞移植的临床应用 造血干细胞移植已广泛用于许多难治性疾病，特别是白血病、肿瘤、遗传性血液病、再生障碍性贫血及难治性免疫性疾病的治疗，取得了显著的效果。到1997年5月，国际上已有五万多患者成功地进行了骨髓干细胞移植，其中二万多人已生存5年以上。全世界共有450万人登记志愿献骨髓，其中170万人已作了HLA配型。但是患者能找到HLA匹配的同胞供者的可能只有30%，而寻找无关供者费时费钱，故异体移植只能使部分患者受益［3］。自体移植、UCBT因疗效确切，HSC来源广泛而倍受推崇，欧洲1995年自体移植病例数占该地区全年所有的移植病例数的68%［9］。
PBSC移植(T)已广泛用于临床，自体(A)PBSCT病例数已超过自体骨髓移植(ABMT)，欧洲1995年自体移植的患者中79%为APBSCT［9］。它具有造血恢复快， 术后并发症少等优点，治疗白血病3年无病生存率(DFS)及复发率(RI)与ABMT相当，适合于实体瘤的治疗［8］。异体PBSCT近年也发展较快，以往人们担心异体PBSCT所输入的PBSC中含有大量淋巴细胞会引起严重GVHD，但实践证明，急性GVHD发生率不比异体BMT高，但慢性GVHD发生率则高于异体BMT［10］。
6 肿瘤细胞的净化 ABMT与APBSCT主要存在的问题是复发率高，移植物中污染的肿瘤细胞是其原因之一，因此，有必要对移植物体外净化。体外净化移植物的方法较多，主要有物理学、化学、生物学、免疫学等方法。有关肿瘤净化方面的文章很多，各种净化方法体外实验均发现有一定效果，但对其临床效果一直存在争论，其主要原因是缺乏随机对照的临床试验加以验证，缺乏有效而可靠的评估净化效果的检测手段。环磷酰胺衍生物Asta-Z、4-HC、mafosfamide等是公认有效的净化药。Laporate等总结1983～1993年10年间125例Asta-Z净化后ABMT的AL患者，84例AML 8年长期生存率(LFS)及RI分别为58%和25%；41例ALL的8年LFS及RI分别为(CR1)56%和37%、(CR2)34%和48%。用单克隆抗体进行免疫净化，主要有两种形式，其一是用针对白血病免疫表型的单抗与相应的抗原结合，借助补体依赖的细胞毒作用、免疫磁珠或免疫毒素等二步效应机制达到净化目的，一般可达到3～6个对数级的杀伤效果；另一种方法是CD34＋细胞选择，经一次纯化后CD34＋细胞的纯度可达60%，并可使肿瘤细胞减少约3个对数级，多次纯化后CD34＋细胞的纯度可达99%，但反复纯化后将会丢失大量干/祖细胞，因此，进行1～2次纯化较合适，这适合于乳腺癌、淋巴瘤、多发性骨髓瘤(MM)等瘤细胞不表达CD34的疾病。此外，可利用白血病祖细胞表达CD38，而早期阶段正常HSC不表达CD38的特点，阳性选择CD34＋CD38-的细胞或先纯化CD34＋细胞，再用白血病细胞特异性抗体借助补体造成对白血病细胞杀伤，达到净化的目的。Schiller等对55例MM患者采用CD34＋细胞阳性选择后行APBSCT，采用PCR检测动员后分离的白细胞及净化后的移植物中患者特异性的免疫球蛋白基因的表达，结果发现移植物中残留瘤细胞可降低2.7～4.5个对数级，但3年无进展生存率为29%，与未净化者没有差别。阳性选择Ph阴性干细胞用于CML患者及大剂量化疗后选择CD34＋细胞用于MDS患者自体移植也在研究中。有关CD34＋细胞纯化的净化意义有待进一步评价。
采用反义技术，针对bcr/abl、PML-RARα、 c-myb、c-myc等癌基因设计反义寡核苷酸序列，使与靶基因结合，终止癌基因表达。体外实验研究发现对bcr/abl断裂点行反义寡核苷酸净化，明显抑制CML细胞克隆生长，但临床疗效尚不肯定。
7 脐血干细胞移植特点 自1988年Gluckman等首次对1例5岁范可尼贫血男孩进行了UCBT获成功以来，已有2?000多人进行了UCBT，成为异体BMT的一种有效替代手段［3］。UCBT具有脐血来源丰富易于采集与冻存，移植后能够长期稳定重建造血，但造血恢复慢，GVHD发生率低等特点［3，11］。目前UCBT主要限于儿童，尽管有84kg重成人UCBT成功的报道，但成人UCBT例数尚少。脐血HSC数对于获得长期植入是一个关键因素，因此成人UCBT还有待干细胞体外扩增技术的发展。
8 HSC体外扩增 一般常用的扩增体系是无血清悬浮培养、依赖基质细胞的培养，在两种体系中加用不同的细胞因子，但一般都是对祖细胞的扩增，LTC-IC变化不是十分显著，如在无血清悬浮培养体系中培养8天，细胞数扩增30倍，至14天时扩增1?000倍以上，而造血祖细胞则扩增190倍，同时CD34＋CD38-、CD34＋HLA-DR-、CD34+Lin-以及耐Asta-Z的CD34＋细胞绝对数也增加3～9倍，而LTC-IC绝对数维持原水平。在含有基质细胞的培养体系中加入SCF、IL-3、GM-CSF、Epo,细胞数扩增21倍，而LTC-IC则增加7.5倍。Kalle等［12］总结以往不同细胞因子组合对HSC体外扩增效果，发现除个别研究者报告LTC-IC可扩增100多倍外，多数研究者报告LTC-IC在体外只可维持原来数目或扩增数倍至数十倍不等。但令人兴奋的是最近意大利学者Piacibello等［13］研究发现在含有Flt3配体及血小板生成素(Tpo)两种生长因子的无基质细胞培养体系中，脐血CD34＋细胞可培养6个月以上，开始培养5周后CD34＋细胞扩增1?600倍，20周时达146?000倍，6个月时CFU-GM达200万倍，尤其是20周时LTC-IC超过20万倍。这一培养体系不仅促进祖细胞的增殖分化，同时促进早期干细胞的扩增，为UCBT用于成人提供了良好的前景。干细胞扩增应用于临床还处于初期阶段，临床已证实使用安全，可以促进早期造血植入。干细胞体外扩增还有待于方法学的改进，达到对多能造血干细胞及早期祖细胞的扩增。将来研究扩增CD34＋细胞产生大量活化树突状细胞用于免疫治疗、扩增脐血干细胞用于成人UCBT、尤其是用于基因治疗等将令人瞩目。
9 HSC改造 HSC由于具有自我更新、体外扩增及分化为各系造血细胞的能力，来源丰富且易于体外处理及重建持久造血，HSC及其子代能通过血液循环与全身各器官系统相互作用等优点，由此决定了HSC，尤其是纯化后的HSC是基因治疗的良好靶细胞。尽管已进行了250多项转基因试验，除腺苷脱氨酶(ADA)缺陷患者外，很少有患者直接受益于这种治疗［5，14］。阻碍HSC基因治疗进展的主要原因是目前所使用的载体如逆转录病毒不能将目的基因转入非分裂期细胞、转导效率低等。研究新的载体系统如HIV载体、腺病毒载体，进一步了解HSC的生物学特性等可能会促进基因治疗的发展。
10 HSC处理过程中的质控 为保障患者得到安全有效的治疗，必须加强HSC处理过程中的质量控制，各项操作程序规范化，严格掌握适应证与禁忌证。世界上不少国家都制定了相应的法规，以保证造血干细胞采集、处理及保存过程中的质量。在这些过程中发生病原微生物污染是不容忽视的问题。PBSCT所需CD34＋细胞数，国外最低标准为2×10６/kg，但各国之间，各实验室之间CD34＋细胞检测时可变因素较多，差异较大，因此应规范操作步骤，保持试剂的稳定性；动员后PBSC峰值时间只有1～2天，应很好地把握；正常供者用G-CSF动员PBSC，尽管已证实对供者早期无影响，但是远期影响还有待观察，动员过程中当WBC≥70×10９/L时应减少G-CSF用量，供体有炎症、自身免疫性疾病或风湿病、动脉粥样硬化或脑血管病变是动员PBSC的禁忌证；UCBT尚处于初期阶段，所需最低有核细胞数、CD34＋细胞数、CFU-GM数还有待于研究，建立脐血库过程中，必须由经过培训的专业人员在高清洁度的场所严格无菌消毒后采集脐血，严格掌握采集适应证与禁忌证，采集的脐血必须在24小时内处理，包括对脐血进行HSC质量、血型、HLA-Ⅰ与HLA-Ⅱ类抗原、细菌与霉菌检测，对脐血及母体血进行乙肝、抗HIV-Ⅰ、抗HIV-Ⅱ、抗-HCV、抗-CMV检测，然后冷冻保存，胎儿出生后必须观察3～6个月，确无失天性及遗传性疾病其脐血方可用于UCBT?［15］。
作者单位：300020 天津，中国医学科学院、中国协和医科大学血液学研究所血液病医院
参 考 文 献
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