张晓明综述 焦新安审校
（扬州大学， 江苏扬州 225009）
摘要 减毒沙门氏菌通过自然感染的方式高效地将DNA疫苗直接运送给体内的抗原提呈细胞(APCs)如树突细胞（DCs）和巨噬细胞，在粘膜和全身淋巴组织诱发以Th1型应答为主的细胞免疫和体液免疫, APCs尤其是DCs可能在其中起到了关键作用。减毒沙门氏菌已被应用于运送病毒、细菌和肿瘤DNA疫苗并取得一定效果,该途径所诱发的细胞免疫要强于肌注途径接种的相同DNA疫苗和减毒沙门氏菌运输的编码相同抗原的原核表达质粒。本文还对如何增强携带DNA疫苗的重组减毒沙门氏菌的免疫效果作了探讨。
关键词 减毒沙门氏菌; DNA疫苗; 树突细胞; 巨噬细胞; 免疫应答
在过去的十年中，DNA疫苗得到迅速的发展。DNA疫苗可诱导机体产生细胞免疫和体液免疫,它具有制备相对简单,运输保存容易,可方便构建多价疫苗和加入多种免疫佐剂分子等优点。DNA疫苗的免疫方法主要有肌肉注射，皮内(包括使用基因枪法)、皮下接种。然而这些方法都存在DNA摄取效率低或需特殊设备等缺点。采用重组减毒胞内菌（如沙门氏菌，志贺氏菌，李斯特菌）通过粘膜自然感染途径运送DNA疫苗是一类很有希望的方法（1），这些细菌可将DNA疫苗直接呈送给APCs，具有运送效率高，免疫方法简单，免疫效果好（包括载体菌本身可作为免疫佐剂），能同时激活粘膜免疫和全身免疫，并可获得对载体菌的免疫等优点。
沙门氏菌是一类重要的人兽共患病原菌，目前对它的研究已很详尽, 遗传背景清楚, 易于操作和控制, 利用它作为载体原核表达各种外源抗原已得到广泛的研究并取得良好的免疫效果（2）；而利用沙门氏菌作为DNA疫苗运送载体的研究方兴未艾，已显示出诱人的前景。
1 减毒沙门氏菌的侵入途径
在肠道沙门氏菌侵入机体的途径可分为两种：以M细胞为代表的上皮细胞途径和非上皮细胞途径。具有侵袭力的沙门氏菌可选择性地侵入派伊尔结(PP)的M细胞并破坏M细胞(2),然后可被位于上皮下穹隆区（SED）的APCs捕获。DCs被认为是早期吞噬沙门氏菌的主要细胞,因为在SED巨噬细胞缺乏,而DCs却大量存在（2）。Hopkins等（3）发现小鼠口服减毒沙门氏菌PhoPc株后最早被PP的DCs吞噬并能在其中存活一段时间。
沙门氏菌还可通过吞噬细胞直接吞噬的非上皮细胞途径侵入机体。Vazquez-Torres等（4）发现CD18+ 吞噬细胞在肠道直接吞噬缺乏侵袭力的沙门氏菌并将其运送至脾脏，Rescigno等（5）进一步证明了DCs可打开肠道上皮间的紧密连接直接进入肠腔吞噬沙门氏菌，同时DCs能分泌紧密连接蛋白，保证了肠上皮细胞屏障的完整性。缺乏侵袭力的沙门氏菌在口服后15分钟就出现在血液中,30分钟达到高峰（4）， 小鼠血清中可产生针对沙门氏菌的抗体反应，但不能在肠道粘膜诱生抗体反应（4），这说明沙门氏菌侵入的非上皮细胞途径与上皮细胞途径是相互独立的。
突破肠道屏障重组沙门氏菌被吞噬细胞吞噬后，被运送至相关粘膜和全身淋
巴组织（2）。Paglia等(6)发现小鼠口服携带绿色荧光蛋白（GFP）真核表达质粒的
重组沙门氏菌后, GFP可在脾脏的 DCs和巨噬细胞中表达。Flo等(7)作了更为精细的实验，他们将GFP真核表达质粒的GFP基因内插入人类α球蛋白内含子，该质粒只有在真核细胞内转录并剪切去内含子的情况下才表达产生荧光的GFP。小鼠口服携带该质粒的重组沙门氏菌后，GFP在脾脏、 PP和小肠粘膜固有层的DCs和巨噬细胞中表达。以上实验证实了采用减毒沙门氏菌运载DNA疫苗至粘膜和全身免疫组织中特定APCs的可行性。
2 减毒沙门氏菌的胞内定位及对DNA疫苗的呈送
沙门氏菌在进化中获得了多种逃避宿主细胞杀伤的机制(8),沙门氏菌被宿主细胞吞噬后将停留在吞噬泡内,不能逃离进入胞液,。不具有逃离吞噬泡功能的DNA疫苗重组沙门氏菌可诱发机体产生有效的免疫应答，那么减毒沙门氏菌荷载的DNA疫苗是如何离开吞噬泡而进入胞液的呢？目前这一机制尚不明了，在体外实验中,不具有逃离吞噬泡功能的重组沙门氏菌可直接呈送DNA疫苗给腹腔原代巨噬细胞（9）(22)(23)和DCs（10）（34），而不能给巨噬细胞系细胞（9）。Rodriguez等(11)在DCs中发现了一种吞噬泡-胞液抗原转运机制,目前对该类机制还不很清楚,可能存在一个或几个相关通道(19),但这提示DCs和成熟巨噬细胞吞噬泡内DNA疫苗的转运可能与此相关。
有证据表明获得逃离吞噬泡功能的重组沙门氏菌呈送DNA疫苗的效率要高于不具有逃离吞噬泡功能的重组沙门氏菌。在体外实验中，Catic等(12)报道表达李斯特溶血素(Hly)-OVA DNA疫苗重组沙门氏菌促进了巨噬细胞MHC I 类途径OVA抗原的提呈; 最近Gentschev等(13)证实分泌Hly的重组沙门氏菌可有效破坏巨噬细胞的吞噬泡膜;进一步经口服或腹膜内免疫小鼠,发现摄取DNA疫苗并表达目的抗原的腹腔巨噬细胞数量比免疫不分泌Hly的重组沙门氏菌小鼠组要高2至3倍。采用含Hly重组沙门氏菌的另一个优点是可克服某些APCs摄取DNA疫苗的限制性。
携带DNA疫苗的重组菌释放DNA疫苗一般是在自身自然裂解后发生,一种很有希望的方法是人工诱导重组菌裂解。Jian 等(14)将λ噬菌体S和R基因置于阿拉伯糖可诱导启动子PBAD之下,在体外诱导条件下,鼠伤寒沙门氏菌裂解释放质粒DNA; Dietrich等(15)将李斯特菌特异的噬菌体裂解基因导入李斯特菌,在李斯特菌逃离吞噬泡进入胞液后噬菌体裂解基因表达, 李斯特菌裂解释放DNA疫苗。
3携带DNA疫苗重组减毒沙门氏菌诱发机体免疫应答的机制
重组减毒沙门氏菌携带的DNA疫苗如何激发机体的细胞免疫和体液免疫?目前这一机制尚不很清楚, Darji等（9）(16)设想了以下途径: DCs和巨噬细胞吞噬侵入肠粘膜屏障的重组沙门氏菌并被激活,活化的 DCs和巨噬细胞迁移至脾脏等淋巴组织(DCs具很强的迁移能力,而巨噬细胞尚有疑问(2)),此时载体菌裂解, DNA疫苗以某种途径进入胞液,然后进入细胞核,表达目的抗原。接着特异的CTL被激活，裂解表达抗原的APCs，APCs内的抗原被释放激活辅助T细胞和诱生抗体反应，至此细胞免疫和体液免疫均被激活，且载体菌的成分如LPS和DNA疫苗上的免疫刺激序列（ISS）等还可作为佐剂加强免疫应答。另外一条运输途径是CD18+ 吞噬细胞（4）和DCs（5）在肠腔直接吞噬重组菌并运送至相关淋巴组织。
另一种可能的机制是重组沙门氏菌引起吞噬它的APCs的凋亡，凋亡产物（可含目的抗原/DNA疫苗）被邻近的APCs吞噬。Yrlid等（17）在体外实验中发现鼠伤寒沙门氏菌14028可诱导髓源巨噬细胞凋亡，作为"旁观者"的巨噬细胞和DCs都可吞噬凋亡产物。DCs在DNA疫苗免疫中的"交叉激活(cross-priming)"作用已得到重视（18），体内实验显示小鼠CD8+ DCs是"交叉提呈(cross-presentation)"抗原的主要APCs，在微生物刺激下，CD8-CD4- DCs也可起"交叉提呈"作用(19)。
4 携带DNA疫苗重组减毒沙门氏菌的应用
4.1 病毒疫苗
4.1.1 人类免疫缺陷病毒(HIV)疫苗
携带编码HIV囊膜蛋白DNA疫苗的重组鼠伤寒沙门氏菌SL7207经胃免疫小鼠可同时在脾脏和PP诱生HIV囊膜蛋白特异的IFN-γ-分泌CD8+ T细胞,而肌内免疫同样的DNA疫苗只能在脾脏产生HIV囊膜蛋白特异的CD8+ T细胞,两种免疫方法均不能有效诱生HIV囊膜蛋白特异的IFN-γ-分泌CD4+ T细胞(20)。与此相对应的是，重组鼠伤寒沙门氏菌原核表达HIV gp120-沙门氏菌外膜蛋白OmpA 融合蛋白可诱生HIV特异的sIgA和CD4+ T细胞(21),但不能产生HIV特异的CD8+ T细胞(20)。以上实验首次报道了携带HIV DNA疫苗的重组鼠伤寒沙门氏菌在粘膜免疫系统产生了HIV特异的CD8+ T细胞，这对于发展HIV疫苗，防止HIV经粘膜途径传播有积极意义。同时还说明单一免疫方法不能有效激活体内的免疫通路，将携带HIV原核表达质粒和真核表达质粒的重组沙门氏菌结合起来可能会产生更好的效果。
4.1.2 乙型肝炎病毒(HBV) 疫苗
Woo等(22)用携带HBsAg DNA疫苗的重组鼠伤寒沙门氏菌SL7207口服免疫小鼠,并与肌注DNA疫苗和腹膜下免疫重组HBsAg的免疫方法进行比较。结果发现口服重组沙门氏菌组可诱生与肌注DNA疫苗组相当强度的CTL反应，重组HBsAg免疫组的CTL反应最弱；抗体反应为重组HBsAg免疫组产生的HBsAg特异的IgG最高，肌注DNA疫苗组次之，口服重组沙门氏菌组的抗体反应很弱。 进一步的研究（23）发现口服重组沙门氏菌组引发最强的Th1和CTL反应，产生的很弱IgG2a抗体；重组HBsAg免疫组引发很强的IgG1(Th2)抗体反应, Th1和CTL反应很弱; 肌注DNA疫苗组产生的抗体谱和强度与重组HBsAg免疫组相当,但也可诱生中等强度的Th1和CTL反应。以上实验说明不同途径的免疫方法诱发肌体产生不同类型的免疫应答, 口服携带HBsAg DNA疫苗的重组沙门氏菌可产生很强的CTL反应而抗体反应很弱,显示出它作为治疗性疫苗的优势。
作为APCs的巨噬细胞在口服重组沙门氏菌免疫中的重要作用也得到证实（23）。小鼠腹腔巨噬细胞体外感染携带HBsAg DNA疫苗的重组沙门氏菌可表达HBsAg，刺激HBsAg特异的脾细胞增殖和Th1细胞分泌IFN-γ，以及HBsAg特异的CTL反应，提示巨噬细胞能从MHCⅠ、Ⅱ两类途径提呈HBsAg，而巨噬细胞却不能有效提呈直接外加的HBsAg，说明沙门氏菌载体/DNA疫苗骨架还起到强免疫佐剂的作用。静脉或腹膜内输注含有重组沙门氏菌的巨噬细胞给同系未免疫小鼠可诱生与口服免疫重组沙门氏菌相类似的免疫应答。然而，作为最强APCs的DCs在口服重组沙门氏菌免疫应答中的作用还需得到阐明。
4.1.3 丙型肝炎病毒(HCV) 疫苗
小鼠口服免疫携带HCV-NS3 DNA疫苗的重组鼠伤寒沙门氏菌可诱发HCV特异的CTL反应（24）。体外实验显示，86%小鼠产生了针对免疫显性表位NS3-1073特异的IFN-γ-分泌T细胞，并能持续10个月之久；小鼠还能产生表位NS3-1169特异的细胞毒和IFN-γ-分泌T细胞，对表位NS3-1406也能产生特异的IFN-γ-分泌T细胞。引发CTL的最低DNA疫苗量为2ng。用重组表达HCV-NS3的牛痘病毒攻击小鼠，口服重组沙门氏菌组体内的病毒滴度大大低于口服空载体组。
4.1.4 单纯疱疹病毒(HSV) 疫苗
Flo等(7)比较了小鼠口服携带HSV-糖蛋白D(gD) DNA疫苗的重组鼠伤寒沙门氏菌和肌注相同gD DNA疫苗效果的比较。两组均产生Th1类为主的抗体反应，肌注DNA疫苗组的抗体水平要高于口服重组菌组，但后者IgG2a/IgG1比值较前者大。两组均可激活脾脏HSV特异的CD4+ T细胞，都产生很强的DTH反应。经体外灭活HSV刺激后，两组脾脏的IFN-γ-分泌细胞均显著增多，但口服重组菌组要高两倍，而且只有口服重组菌组的PP和回肠淋巴结产生IFN-γ-分泌细胞。当低剂量HSV毒株攻毒时，只有口服重组菌组可有效控制感染。以上实验说明小鼠口服重组沙门氏菌比肌注DNA疫苗更能有效地激活局部细胞免疫反应，而细胞免疫对于预防HSV从粘膜途径感染是相当重要的（7）。
4.1.5. 伪狂犬病病毒(PrV)疫苗
Shiau等(25)用运载PrV糖蛋白gD DNA疫苗的重组沙门氏菌口服免疫小鼠,可诱发抗PrV抗体, PrV特异的淋巴细胞增殖和CTL反应,并能在PrV毒株攻击下有效保护小鼠；同时口服携带PrV gD真核表达质粒和胸腺素原α真核表达质粒重组沙门氏菌可增强上述免疫应答，免疫一次就能使小鼠免受PrV毒株的致死攻击。
4.2细菌疫苗
携带鞭毛蛋白-突变型大肠杆菌耐热肠毒素融合蛋白(FLA-STmt)原核表达质粒的重组鼠伤寒沙门氏菌口服免疫小鼠不能引发小鼠对鞭毛蛋白的免疫应答,而携带FLA-STmt真核表达质粒的重组菌可诱生低滴度的抗鞭毛蛋白IgG抗体,但两种方法均不能诱发对STmt的免疫应答（26）。
Pasetti等（27）发现携带表达破伤风毒素C末端(Frag C)原核和真核表达质粒的重组伤寒沙门氏菌鼻内免疫小鼠均可诱生高滴度的抗Frag C IgG1, IgG2a和IgG2b且携带真核质粒的重组菌产生的抗体滴度比携带原核质粒的重组菌的要高;肌内接种表达Frag C的真核质粒产生中等滴度的抗Frag C IgG1, IgG2a和IgG2b;而肌内直接接种Frag C则诱生高滴度的IgG1和中等滴度的IgG2a和IgG2b。与此对应的是，体外Frag C刺激脾细胞实验表明携带原核和真核质粒的重组菌组IFN-γ显著增高；肌内接种真核质粒组IFN-γ和IL-2显著增高，而肌内直接接种Frag C组则分泌高水平的IL-4、5及IL-2、IFN-γ。以上实验说明携带原核和真核质粒的重组伤寒沙门氏菌及肌内接种真核质粒同时诱导了小鼠的Th1和Th2反应，而肌内直接接种Frag C主要诱导了Th2反应, 携带真核质粒重组菌的免疫效果要优于携带原核质粒的重组菌和肌内接种真核质粒。
Darji等（9）用携带李斯特菌溶血素DNA疫苗的重组鼠伤寒沙门氏菌口服免疫小鼠,获得了很强的CTL、Th1型CD4+ T细胞和混合型抗体反应(高水平IgG2a和IgG 1),并能保护小鼠免受致死量李斯特菌的攻击。Darji等（16）还发现沙门氏菌介导的DNA疫苗免疫可诱生免疫记忆，增强重组沙门氏菌的侵袭力可加强免疫效果，另外发现鼻内接种和经口途径都可诱发全身免疫，但粘膜免疫的效果不一样：口服免疫可在肠道而不在肺产生抗体；鼻内免疫在肺而不在肠道产生抗体。这可能是由于小鼠的耐受性有限，鼻内接种的重组菌不能过多。
4.3 肿瘤疫苗
Paglia等(6)以β半乳糖苷酶(β-gal) 作为人工肿瘤抗原,小鼠口服携带β-gal DNA疫苗的重组沙门氏菌可诱发产生Th1型细胞和体液免疫,在表达β-gal的纤维肉瘤细胞攻击下,小鼠获得了一定的保护力,免疫组生长肿瘤的小鼠数比对照组少且肿瘤小,前者的生存期比后者明显延长。Zoller等(28)也将β-gal作为人工肿瘤抗原,比较了小鼠三种免疫方法的效果。结果静脉输注含有β-gal的DCs抑瘤效果最好，口服重组减毒鼠伤寒沙门氏菌SL7207（含β-gal DNA疫苗）次之，肌注β-gal DNA疫苗效果最差。荷有β-gal的DCs主要激活CD4+ Th通路，而口服重组菌主要激活CD8+ CTL通路。将上面两种免疫方法结合，小鼠先口服免疫重组菌，再静脉输注荷有β-gal的DCs作加强免疫，两个通路都得到充分激活，形成优势互补，效果达到最佳，在十倍致死量肾癌细胞（RENCA-β-gal）的攻击下有超过半数的免疫小鼠未生长肿瘤。
美国Scripps研究所作了一系列重组减毒鼠伤寒沙门氏菌运载肿瘤DNA疫苗的工作,涉及的肿瘤有黑色素瘤(29)(30)、成神经细胞瘤(31)、肠癌(32)(34)、肺癌(33)。减毒鼠伤寒沙门氏菌SL7207运输表达小鼠黑色素瘤gp10025-33和TRP-2181-188肽表位的DNA疫苗，在该疫苗未连接泛素基因时不能诱发有效抗肿瘤T细胞免疫，但在目的基因上游泛素化以后可打破外周耐受，激发有效的CTL反应，说明泛素能增强机体对肿瘤抗原的处理和提呈能力(29)。在用抗神经节苷脂 GD2- IL-2融合蛋白 (ch14.18-IL2)作加强免疫后，免疫效果进一步增强，8只小鼠中有6只能完全消除攻击的肿瘤细胞，另两只皮下的肿瘤生长也大受抑制(30)。该免疫效果的取得是与CD4+ T细胞在CD8+ T细胞杀瘤效应阶段的辅助分不开的。本实验说明：1，运用ch14.18-IL2将IL-2导向肿瘤微环境可增强抗肿瘤免疫；2，CD4+ T细胞的辅助对CTL效应是相当重要的。用减毒鼠伤寒沙门氏菌运送表达酪氨酸羟化酶抗原的DNA疫苗口服免疫小鼠可保护小鼠免受成神经细胞瘤细胞致死量的攻击(31)。用减毒鼠伤寒沙门氏菌运输表达癌胚抗原(CEA)的DNA疫苗可激发有效的CD8+ T细胞抗肿瘤免疫（肠癌（32），肺癌（33）），并可被重组抗体-IL2融合蛋白所做的加强免疫增强。在将CD40L与CEA共表达，再用重组抗体huKS1/4-IL-2融合蛋白作加强免疫后，100%的小鼠在受肠癌细胞攻击后不生长肿瘤，DCs和CTLs被有效激活（34）。
最近，Cochlovius等（35）进行了沙门氏菌荷载表达人类黑色素瘤糖蛋白hgp100 DNA疫苗的实验。在体外实验中，该DNA疫苗可被DCs高效摄取和表达；对小鼠进行口服免疫，3天后发现gp100在肠系膜淋巴结树突样细胞中表达，该疫苗诱生很强的CTL应答并能在B16-hgp100肿瘤细胞的攻击下70%的免疫组小鼠不生长肿瘤。免疫组小鼠的脾细胞体外经B16-hgp100肿瘤细胞刺激后， CD8+ T细胞和IFN-γ-分泌细胞的数量显著增多，但CD4+ T细胞的数目没有增多。
5 小结与展望
尽管DNA疫苗已得到广泛的研究,其免疫效果却不尽如人意,一些在小鼠实验中很有效的DNA疫苗在人体试验的结果也令人失望,一个重要的原因是运用常规接种途径(肌肉注射，皮内接种) 淋巴组织摄取的抗原量有限(36)。Maloy等(36)比较了淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)gp33 DNA疫苗几种免疫途径的效果, 结果发现腹股沟淋巴结直接注射DNA疫苗诱生的CTL反应比肌肉注射和皮内接种相同DNA疫苗高100-1000倍,在攻毒实验中只有淋巴结注射组小鼠可抵抗表达LCMV gp33的牛痘病毒和肿瘤细胞的攻击。这显示出DNA疫苗直接导入淋巴组织这一接种途径的优越性, 从理论上支持了采用重组沙门氏菌直接运送DNA疫苗至体内APCs的方法。
用于改进常规DNA疫苗的方法完全适用于重组沙门氏菌荷载的DNA疫苗，如共表达胸腺素原α(25)、泛素（29）（30）、CD40L（34）。这些分子佐剂的应用对粘膜途径免疫还有着特别的意义，小鼠对重组菌的接种量有一定的限度，因为革兰氏阴性菌的细胞壁LPS对其有一定的毒性，如鼻内接种量不能大，这就影响了免疫效果（16）；而加入分子佐剂后增强了免疫效果并可减少接种的次数。另外通过增强沙门氏菌的侵袭力（16）或增加沙门氏菌逃离吞噬泡的功能也能提高免疫应答的效果（12）（13）。也有报道在口服免疫时同时服用氨苄青霉素增加DNA疫苗免疫效果的报道（37），这可能是抗生素增加了DNA疫苗在沙门氏菌体内的稳定性。
总体上看，粘膜途径接种荷载DNA疫苗的重组沙门氏菌主要诱生Th1型应答和很强的CTL活性，其免疫应答强度要大于其它免疫方法（包括肌注相同的DNA疫苗，原核表达的重组沙门氏菌，接种蛋白质抗原），除能激活全身免疫外还活化了粘膜免疫，这对预防粘膜途径传播的病原微生物，特别是需要细胞免疫的显得十分重要。但不同的报道间也存在着一定的差异，体液免疫应答的抗体水平的差异尤为明显。这可能与选取的目的抗原和免疫方法的不同有关。一个重要的认识是高效CTL效应的取得依赖于CD4+ T细胞的辅助(30), Coombes建议在设计CTL效应为目的DNA疫苗时也需同时加入MHCⅠ类和Ⅱ类限制性表位(18)。
APCs是诱发沙门氏菌携带的DNA疫苗免疫应答的关键因素，产生强Th1型应答是通过作为强Th1型佐剂的载体菌和DNA疫苗上的免疫刺激序列作用于APCs来达到的, APCs上的不同Toll样受体(TLRs)可能在Th1型刺激性信号的接受和传导方面起主导作用（38）（39）。巨噬细胞在HBsAg DNA疫苗的免疫应答中起到重要作用（21）；而DCs被认为是DNA疫苗诱发细胞免疫的主要APCs(18),DCs应在此免疫应答中起更重要的作用，一些实验也正在证实这一点(6)(7)（10）(33)(34)（35）。DCs的功能具有可塑性，它最终诱发免疫应答的结果取决于自身来源（不同的亚群）和分化程度，微环境和抗原的类型等因素的综合影响（38）（39），这就为我们优化重组疫苗包括连接各种佐剂分子来控制免疫应答的结果奠定了理论基础。
粘膜免疫的一个优点是一处免疫其它部位粘膜组织的粘膜免疫也被激活。如口服携带沙眼衣原体主要外膜蛋白(MOMP) DNA疫苗重组沙门氏菌可保护小鼠从呼吸道所受的沙眼衣原体攻击(40); 口服携带HSV gD DNA疫苗的重组沙门氏菌的小鼠可控制HSV生殖道粘膜的感染(7)。但不同粘膜途径的免疫也会产生一定的结果差异（16）。
沙门氏菌两种不同的侵入途径也给我们新的提示。缺乏侵袭力的沙门氏菌可诱生全身免疫而不产生粘膜免疫（4），这就使得我们可以通过口服免疫来完成一些不需要粘膜免疫的全身免疫。
沙门氏菌与体内特定APCs亲和的特性还可被用作基因治疗，矫正APCs的基因缺陷。沙门氏菌携带的IFN-γ真核表达质粒可在IFN-γ基因缺失的小鼠巨噬细胞中表达, IFN-γ基因缺失的小鼠口服此重组沙门氏菌后获得了自然抵抗细菌感染的能力（41）。
减毒沙门氏菌给我们提供了一个简单、高效DNA疫苗免疫的方法，然而从目前的研究来看，单一的免疫途径往往很难达到很令人满意的免疫效果，口服沙门氏菌携带的DNA疫苗一般不能同时有效活化体内相关免疫通路,更强的免疫应答需要其它免疫方法的联合使用（28）（30）（32）（33）（34）。我们实验室今后的研究重点将放在优化重组减毒沙门氏菌疫苗和/或组合几种免疫途径以充分激活体内免疫通路，从而取得高效、持久的免疫应答。
参 考 文 献
1 Dietrich G, Spreng S, Gentschev I, et al. Bacterial systems for the delivery of eukaryotic antigen expression vectors. Antisense Nucleic Acid Drug Dev, 2000,10(5): 391～399
2 Sirard J C, Niedergang F, Kraehenbuhl J P. Live attenuated Salmonella: a paradigm of mucosal vaccines. Immunol Rev, 1999,171: 5～26
3 Hopkins S A, Niedergang F, Corthesy-Theulaz I E, et al. A recombinant Salmonella typhimurium vaccine strain is taken up and survives within murine Peyer's patch dendritic cells. Cell Microbiol, 2000,2(1): 59～68
4 Vazquez-Torres A, Jones-Carson J, Baumler A J, et al. Extraintestinal dissemination of Salmonella by CD18-expressing phagocytes. Nature, 1999,401(6755): 804～808
5 Rescigno M, Urbano M, Valzasina B, et al. Dendritic cells express tight junction proteins and penetrate gut epithelial monolayers to sample bacteria. Nat Immunol, 2001,2(4): 361～367
6 Paglia P, Medina E, Arioli I, et al. Gene transfer in dendritic cells, induced by oral DNA vaccination with Salmonella typhimurium, results in protective immunity against a murine fibrosarcoma. Blood, 1998,92(9): 3172～3176
7 Flo J, Tisminetzky S, Baralle F. Oral transgene vaccination mediated by attenuated Salmonellae is an effective method to prevent Herpes simplex virus-2 induced disease in mice. Vaccine, 2001,19(13-14): 1772～1782
8 Pieters J. Evasion of host cell defense mechanisms by pathogenic bacteria. Curr Opin Immunol, 2001,13(1): 37～44
9 Darji A, Guzman C A, Gerstel B, et al. Oral somatic transgene vaccination using attenuated S.Typhimurium. Cell, 1997,91(6): 765～775
10 Dietrich G, Kolb-Maurer A, Spreng S, et al. Gram-positive and Gram-negative bacteria as carrier systems for DNA vaccines. Vaccine, 2001, 19(17-19): 2506～2512
11 Rodriguez A, Regnault A, Kleijmeer M, et al. Selective transport of internalized antigens to the cytosol for MHC class Ⅰ presentation in dendritic cells. Nat Cell Biol, 1999,1(6): 362～368
12 Catic A, Dietrich G, Gentschev I, et al. Introduction of protein or DNA delivered via recombinant Salmonella typhimurium into the major histocompatibility complex class I presentation pathway of macrophages. Microbes Infect, 1999,1(2): 113～121
13 Gentschev I, Dietrich G, Spreng S, et al. Recombinant attenuated bacteria for the delivery of subunit vaccines. Vaccine, 2001,19(17-19): 2621～2628
14 Jain V, Mekalanos J J. Use of the lambda phage S and R gene products in an inducible lysis system for Vibrio cholerae and Salmonella enterica Serovar typhimurium-based DNA vaccine delivery system. Infect Immun, 2000,68(2): 986～989
15 Dietrich G, Bubert A, Gentschev I, et al. Delivery of antigen-encoding plasmid DNA into the cytosol of macrophages by attenuated suicide Listeria monocytogenes. Nat Biotechnol, 1998,16(2): 181～185
16 Darji A, Lage S Z,Garbe A, et al. Oral delivery of DNA vaccines using attenuated Salmonella typhimurium as carrier. FEMS Immunol Med Microbiol, 2000,27(4): 341～349
17 Yrlid U, Wick M J. Salmonella-induced apoptosis of infected macrophages results in presentation of a bacteria-encoded antigen after uptake by bystander dendritic cells. J Exp Med, 2000,191(4): 613～624
18 Coombes B K, Manhony J B. Dendritic cells discoveries provide new insight into the cellular immunobiology of DNA vaccines. Immunol Lett, 2001,78(2): 103～111
19 Heath W R, Carbone F R. Cross-presentation in viral immunity and self-tolerance. Nat Rev Immunol, 2001,1: 126～134
20 Shata M T, Reitz M S Jr, DeVico A L, et al. Mucosal and systemic HIV-1 Env-specific CD8(+) T-cells develop after intragastric vaccination with a Salmonella Env DNA vaccine vector. Vaccine, 2002,20(3-4): 623～629
21 Wu S, Pascual D W, Lewis G K, et al. Induction of mucosal and systemic responses against human immunodeficiency virus type 1 glycoprotein 120 in mice after oral immunization with a single dose of a Salmonella-HIV vector. AIDS Res Hum Retroviruses, 1997,13(14): 1187～1194
22 Woo P C, Wong L P, Zheng B J, et al. Unique immunogenicity of hepatitis B virus DNA vaccine presented by live-attenuated Salmonella typhimurium. Vaccine, 2001,19(20-22): 2945～2954
23 Zheng B J, Woo P C, Ng M, et al. A crucial role of macrophages in the immune responses to oral DNA vaccination against hepatitis B virus in a murine model. Vaccine, 2002,20(1-2): 140～147
24 Wedemeyer H, Gagneten S, Davis A, et al. Oral immunization with hcv-ns3-transformed Salmonella: induction of hcv-specific ctl in a transgenic mouse model. Gastroenterology, 2001,121(5): 1158～1166
25 Shiau A, Chen Y, Liao C, et al. Prothymosin alpha enhances protective immune responses induced by oral DNA vaccination against pseudorabies delivered by Salmonella choleraesuis. Vaccine, 2001,19(28-29): 3947～3956
26 Pereira C M, Guth B E, Sbrogio-Almeida M E, et al. Antibody response against Escherichia coli heat-stable enterotoxin expressed as fusions to flagellin. Microbiology, 2001,147(4): 861～867
27 Pasetti M F, Anderson R J, Noriega F R, et al. Attenuated deltaguaBA Salmonella typhi vaccine strain CVD 915 as a live vector utilizing prokaryotic or eukaryotic expression systems to deliver foreign antigens and elicit immune responses. Clin Immunol, 1999,92(1): 76～89
28 Zoller M, Christ O. Prophylactic tumor vaccination: comparison of effector mechanisms initiated by protein versus DNA vaccination. J Immunol, 2001,166(5): 3440～3450
29 Xiang R, Lode H N, Chao T H, et al. An autologous oral DNA vaccine protects against murine melanoma. Proc Natl Acad Sci U S A, 2000,97(10): 5492～5497
30 Niethammer A G, Xiang R, Ruehlmann J M, et al. Targeted interleukin 2 therapy enhances protective immunity induced by an autologous oral DNA vaccine against murine melanoma. Cancer Res, 2001,61(16): 6178～6184
31 Lode H N, Pertl U, Xiang R, et al. Tyrosine hydroxylase-based DNA-vaccination is effective against murine neuroblastoma. Med Pediatr Oncol, 2000,35(6): 641～646
32 Xiang R, Silletti S, Lode H N, et al. Protective immunity against human carcinoembryonic antigen (CEA) induced by an oral DNA vaccine in CEA-transgenic mice. Clin Cancer Res, 2001,7(3 Suppl): 856～864
33 Niethammer A G, Primus F J, Xiang R, et al. An oral DNA vaccine against human carcinoembryonic antigen (CEA) prevents growth and dissemination of Lewis lung carcinoma in CEA transgenic mice. Vaccine, 2002,20(3-4): 421～429
34 Xiang R, Primus F J, Ruehlmann J M, et al. A dual-function DNA vaccine encoding carcinoembryonic antigen and CD40 ligand trimer induces T cell-mediated protective immunity against colon cancer in carcinoembryonic antigen-transgenic mice. J Immunol, 2001,167(8): 4560～4565
35 Cochlovius B, Stassar M J, Schreurs M W, et al. Oral DNA vaccination: antigen uptake and presentation by dendritic cells elicits protective immunity. Immunol Lett, 2002,80(2): 89～96
36 Maloy K J, Erdmann I, Basch V, et al. Intralymphatic immunization enhances DNA vaccination. Proc Natl Acad Sci USA, 2001,98(6): 3299～3303
37 Woo PC, Tsoi H W, Leung H C, et al. Enhancement by ampicillin of antibody responses induced by a protein antigen and a DNA vaccine carried by live-attenuated Salmonella enterica serovar Typhi. Clin Diagn Lab Immunol, 2000,7(4): 596～599
38 Liu Y J, Kanzler H, Soumelis V, et al. Dendritic cell lineage, plasticity and cross-regulation. Nat Immunol, 2001,2(7): 585～589
39 Pulendran B, Palucka K, Bancheau J. Sensing pathogens and tuning immune response. Science, 2001,293(5528):253～256
40 Brunham R C, Zhang D. Transgene as vaccine for chlamydia. Am Heart J, 1999,138(5 Pt 2): S519～S522
41 Paglia P, Terrazzini N, Schulze K, et al. In vivo correction of genetic defects of monocyte/macrophages using attenuated Salmonella as oral vectors for targeted gene delivery. Gene Ther, 2000,7(20): 1725～1730
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*国家自然科学基金资助项目 (30170700);高等学校优秀青年教师教学科研奖励计划资助项目
作者简介：张晓明(1977-),男,硕士研究生,主要从事基因疫苗免疫机理方面的研究。
联系地址：扬州大学80225信箱 邮编 225009 E-MAIL： zxiaom@yahoo.com.cn
