吴砂 综述
三峡大学医学院免疫学教研室
摘 要：树突状细胞是至今发现的功能最强的专职抗原提呈细胞，人们能过各种刺激提高其抗原提呈能力和诱导T细胞应答能力，本文简单介绍了树突状细胞疫苗在宫颈癌的免疫治疗方面的新进展。
关键词：树突状细胞，宫颈癌，免疫治疗，疫苗
树突状细胞（Dendritic cell,DC）是目前发现功能最强的专职抗原提呈细胞的（antigen-presenting cell,APC）,虽然在体内数目较少，但其抗原呈递功能远强于巨噬细胞，B细胞等其他抗原呈递细胞，具有强大地激活CD8＋CTL，CD4＋T细胞的功能，并能分泌多种细胞因子参与免疫调节。隨着目前体外培养扩增DC的技术日益成熟，及基因工程技术的进展，采用DC疫苗对肿瘤进行生物治疗已成为生物治疗领域中的一个热点，本文就DC细胞在宫颈癌生物治疗的进展进行综述。
1.DC细胞简介：
它是细胞内抗原加工、提呈的关键细胞，在机体的抗肿瘤免疫中起十分重要的作用。目前研究认为其抗肿瘤的主要机制为（1）DC进入肿瘤,捕获抗原,将其处理后,与MHCⅡ类分子结合成MHCⅡ类分子－抗原肽复合体,表达于细胞膜表面,提呈给Ｔ细胞,为Ｔ细胞提供第一活化信号。在此过程中,DC逐渐成熟,许多粘附分子、共刺激分子表达上调,为Ｔ细胞提供第二活化信号,从而促 发Ｔ细胞大量活化、增殖、分化,产生特异性CＴＬ。（2）肿瘤抗原肽可经MHCⅠ分子途径递呈给CD8+Ｔ细胞,而无需CD4+Ｔ细胞辅助,直接激活诱导CTL反应（3）DC能分泌IL-12,使原始Ｔ细胞生成Th1型应答反应。还可以分泌IL－7，促进CD4、CD8T细胞的增殖及B细胞的分化 (4)DC可通过吞噬凋亡的肿瘤细胞获得抗原,从而启动免疫应答。通过上述机制，DC诱发特异性的CTL，杀伤肿瘤细胞。
2．树突状细胞疫苗进展：
2.1 宫颈癌抗原冲击致敏
通过对宫颈癌的深入研究，已经证实了人乳头瘤病毒（Human papillomavirus ,HPV）与宫颈癌的发病密切相关，尤其是其高危型-HPV16型与18型，它的E6、E7的表达是维持肿瘤细胞处于转化状态所必需的，所以可以将E6、E7原癌蛋白视作肿瘤特异性抗原。
由于DC细胞是最强的APC细胞，所以可以通过在体外用肿瘤抗原进行冲击强化致敏的方法使DC高度表达MHCⅠⅡ类分子，,提呈丰富的肿瘤抗原肽,而共刺激分子、粘附分子如B7-1、B7-2、CD40等表达亦明显上调,可为Ｔ细胞的激活充分提供第一、二活化信号，这类疫苗在体内外均可使Ｔ细胞被有效激活,产生特异性抗肿瘤免疫反应。
2.1.1宫颈癌细胞悬液冲击致敏
将带HPV的SiHa,Caski细胞系与DC 中朗格汉期细胞共同培养，在培养过程中向其中加入800ul/ml GM-CSF与100ul/ml IL-4,发现LC数目明显增多，分化更加成熟，对CTL的呈递作用更强。
2.1.2 宫颈癌HPV蛋白多肽致敏
将宫颈癌HPV所产生的蛋白作为抗原，预先对树突状细胞进行冲击强化，是常用的方法之一，也是比较成熟的方法。Santin AD 等在1999年用重组的，完整的HPV16E7蛋白对自体的DC细胞进行强化，他通过将构造的谷胱甘肽S转移酶（glutathione S-transferase,GST）与E7的融合蛋白转入E.coli BL21来大量生产E7蛋白，再通过脂质体法将E7转入在DC，在随后的体外观察与体内实验中，都出现了明显的CTL增多现象，在细胞毒实验中，宫颈癌肿瘤特异的细胞毒中，发现CTL的功能显著增强。他已将这种方法应用于临床，一名在1997年经过子宫切除术并接受了顺铂化疗及体外放疗的病人在2001年发现病情重新恶化，肿瘤又开始扩散，Santin AD通过皮下注射共进行了十五次DC治疗。为了增加对肿瘤敏感的T细胞数目，在第一次，第二次及第四次注射前均将预先已被HPV18E7蛋白冲击的DC刺激后产生的自体T细胞（1.5×107个细胞）先注入患者体内， 72小时后再注入经HPV18－E7冲击的DC疫苗，头五次DC治疗以10到14天为间隔，而且在每次注射时还加有低剂量的IL－2（106 U/平米体表面积·天）。剩下的则以30到60天为间隔来进行。在注射后，病人出现了注射部位的肿胀及触痛等过敏样症状，但组织活检发现肿瘤受到明显杀伤与抑制。从开始治疗到患者又出现肿瘤细胞扩散，共经历二十个月，不仅生存期明显延长（24个月），而且患者生活质量有明显提高。
不仅完整的E6、E7蛋白可以用来做为抗原来冲击DC，而且HPV的部分蛋白也可以用于刺激强化DC，该DC诱导产生的CTL都能对表达此种蛋白的靶细胞有较高的杀伤力。有实验将HPV-16E7(11-20)肽和外周血PBMC在细胞因子作用下培养,以后每周用经放射线照射过的负载肽的PBMC刺激,同时还将除去DC4+Ｔ细胞的PBMC用转染有HPV-16E7(11-20)的DC刺激,用51Cr释放试验测细胞毒,7个供者中有1个建立了肽特异性CTL系;用负载肽的DC刺激富含CD8+Ｔ细胞的PBMC时,7个供者中获得4个CTL,主要的CTL能够溶解HLA-A2+、HPV-16+宫颈癌细胞系Caski,而HLA Ａ2-、HPV16+的宫颈癌细胞系SiHa仅在转染HLA-Ａ2基因后才能被CTL溶解。这种多肽抗原冲击DC疗法也已进入临床阶段不仅如此，用HPV16 E2蛋白C端的一部分刺激过的DC可以诱导产生大量能释放较多IFN-γ的T细胞，而且其诱导产生的CTL也能特异性溶解表达E2蛋白的靶细胞，通过表型分析，都是CD3＋CD8＋T细胞，而没有E2致敏的在DC诱导出的CTL则没有这个效果。
但是这种方法也有局限性，首先就是其靶向性不高，特异性不是很强，其次，由于蛋白降解及MHC分子循环，抗原蛋白多肽对DC来说，并不是个有效的刺激物，功能维持时间比较短。
2.1.3 HPV的DNA刺激致敏DC
DNA刺激的DC较蛋白抗原冲击法有多个优点，病毒DNA可以产生大量的蛋白作为抗原，转染后可能会持继刺激产生特异CTL；病毒比蛋白更易进入细胞，再者病毒能更好进行表位呈递，促进HLAI类分子的表达（12）；宫颈癌细胞中大量存在的HPV16、18的E6、E7基因都是病毒原癌基因，其产生的E6、E7蛋白能激活特异性的针对E6、E7的CTL反应。所以在宫颈癌的生物治疗上，DNA疫苗成为了一个热点。Mauriizo比较了细胞裂解物刺激的DC，谷胱甘肽S-转移酶（GST）－E7DNA刺激过的DC，以及腺相关病毒－SV40的Neo段－E7DNA（AAV/E7/Neo）刺激的DC在激发机体特异性免疫机体CTL上的异同，发现三者都能激发特异性的CTL，但在许多方面都存在很大差别。用AAV系统转染的DC细胞，其表达CD80、CD83的能力明显强于其他DC，胞内E7蛋白含量是另两种的三到四倍。AAV系统诱生的CTL的T细胞表型一直为CD8＋，低表达CD56，分泌的IFN－γ也明显高于其他系统诱发的CTL。通过对两名临床标本的作用，发现该CTL效果比另两种系统的强2～3倍.不仅如此，还发现通过不同注射途径产生的免疫效果不同，将转有HPV18E7基因的DC通过肌肉注射所激发的免疫应答比皮下注射或静脉滴注都要强，能激发更多的E7特异性抗体及特异CD4＋、CD8＋T细胞前体细胞。但由于HPV16、18的E6、E7DNA本身具有致癌性，所以直接应用该DNA可能存在诱发癌症的危险。
2.1.4 HPV的RNA转染DC
由于RNA不会整合到宿主的染色体上，所以用RNA疫苗在安全性上可能比DNA疫苗要高。将来源于肿瘤组织的RNA转染入DC后，只会产生MHC－I类限制的应答（15）。Thornberg等发现经过编码HPVE6、E7蛋白的RNA冲击过的DC，无论在体外或体内均能激发出特异性的、强烈的针对表达E6、E7蛋白的靶细胞的CTL效应，识别并溶解包括转染E6、E7RNA的树突状细胞在内的靶细胞，而且溶解宫颈癌细胞的能力比E6、E6多肽冲击的DC所激发CTL反应要强。并且还发现，同时转染E6、E7 RNA的树突状细胞所激发的CTL反应产生的溶解效果要优于转染单独一种RNA。
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2.1.5 VLPs冲击DC细胞
HPV的晚期蛋白L1，L2来源的病毒样颗粒（virus-like particle. VLPs）是没有致癌性的病毒蛋白，还发现对于L区的L1，在其羟基端可以携带60个氨基酸而不改变其形成VLP的能力，所以可以在此部位融合上不同的限制性的CTL表位或其他免疫原性肽，此为嵌合性病毒样颗粒（Chimeric virus-like particles,CVLP）它能诱发体液免疫和细胞免疫，所以它可以用做预防性和治疗性疫苗。将HPV－16的CVLP与未成熟DC共同培养48小时后，DC表达CD80与CD83的能力明显提高，分泌的IL－12也大大增加。而且还发现，用嵌合HPV16L1L2－E7的VLPs,所冲击的DC激发的CTL是针对表达E7多肽的靶细胞的(17)。这也为DC疫苗的发展提供了一个新的方向。
2.2 细胞因子作用的树突状细胞疫苗
研究发现粒细胞/巨噬细胞－集落刺激因子（granulocyte/macrop
hage-clony-stimulating factor, GM-CSF）和白介素4(Interleukin-4,IL-4)共同作用下，会使未成熟DC迅速成熟，并提高其抗原提呈能力。将GM－CSF的基因通过腺病毒载体转入与肿瘤细胞融合的DC细胞后，DC在混合淋巴细胞反应中高表达B7和共刺激能力，其表达出的CTL杀伤力更高,而且它还能提高其他非特异性免疫细胞的抗肿瘤能力。
2.3 强化DC表面配体
有研究表明，肿瘤产生的血管内皮生长因子（VEGF）可调节Flt3配体而发挥对DC的作用，该配体是诱导造血前体细胞和DC扩增的生长因子，在体外发现VEGF会抑制该配体，使其表达下降，从而抑制DC成熟，扩增。把Flt3 配体加入到含GM－CSF与IL－4的细胞培养液中后（40ng/ml），发现培养的DC总数增加了约26%，而这些DC的表型保持稳定，此配体还可以增强DC对T细胞的刺激能力，促进T细胞生长。况且，前面提到的不少抗原都可以加强DC上CD80、CD83的表达。
3 结语：
树突状细胞疫苗在宫颈癌治疗方面已取得了初步进展，有些已用于临床，但大部分尚处于实验阶段，目前树突状细胞疫苗在实际应用中存在许多疑问，如免疫应答的维持时间长短，DC疫苗注射途径，剂量，次数，间隔时间，不良反应及副作用等。然而，树突状细胞在宫颈癌的生物治疗方面无疑具有光明的前景。
