Stonemason 译
南京大学生命科学院 （江苏南京，210093）
最近发现的胞浆蛋白质家族--NALPs--在细胞对抗微生物感染的过程通过TLR (toll-like receptor)参与了caspase-1的活化。NALP1结构上和能够激活capspase-9的凋亡蛋白酶激活因子-1（APAF-1）相关，也象后者一样形成了很大的信号诱导多蛋白复合物--炎症小体，从而导致了前炎性caspases的激活。
免疫中最引人注目的问题之一就是宿主器官如何识别感染物质，因为致病原分子千差万别又有着极高的突变率。为了与这种情况相适应，脊椎动物进化出多种免疫识别系统，大致可以分为先天非特异性系统和特异性系统两类。先天免疫是宿主反应的一种更古老、更快的形式，同时也对特异性免疫的建立有着复杂的影响。特异性免疫则是由T细胞和B细胞介导的，具有特异性和记忆能力。在感染中，宿主先天免疫系统的细胞能够有效地识别微生物。这些细胞包括吞噬细胞、内皮细胞、粘膜上皮细胞以及专门的抗原呈递细胞--它们能够表达一系列分子，包括TLRs家族。
TLRs被认为是模式识别受体（PRRs）。它们能够识别许多抗原共有而宿主不表达的分子结构--即抗原相关性分子模式(PAMPs)，例如脂多糖，细菌脂蛋白，肽聚糖，Lipoteichoic Acid，细菌的非甲基化CPG DNA，微生物的lipoarabinomannan以及酵母的甘露聚糖等。这些PAMPs都由特定的TLRs识别。先天性免疫在保护多细胞生物免受感染中的重要作用体现在它的组成上，包括抗原识别分子、信号转导通路和下游效应分子。它们在进化上是保守的，从昆虫、植物到动物都用同样的系统。
TLRs对PAMPs的识别引起不同胞内级联通路的活化，导致多种效应分子的表达。其中一类效应分子包括活性氧和氮以及多种抗微生物的肽类，有着直接杀灭微生物的作用。另一类包括共刺激分子B7.1和B7.2，可作为T细胞活化的第二信号。第三类包括粘附分子、趋化因子和细胞因子。第三类中的白介素1β（IL-1β）和肿瘤坏死因子（TNF）被成为"警报细胞因子"。它们由巨嗜细胞分泌并激活TLRs启动炎症反应。此后淋巴细胞浸润有效地清除感染物质。
IL-1β可引起炎症反应，而更重要的是它同时诱导前炎性基因--如诱生型一氧化氮合成酶（iNOS）、IL-6和其他细胞因子、趋化因子的表达。此外，IL-1β能够提高粘附分子的表达，促进淋巴细胞从血液浸润到组织。静脉注射IL-1β可能是最强烈的致热原。IL-6最初合成成为无活性的前体，因缺少信号肽而留在细胞内。活化时要先转变为活化分子再分泌出来。IL-1β转化酶（ICE）--也称caspase1--负责这一过程。Caspase1将胞内的IL-1β前体在116位天冬氨酸切开，形成活化的成熟IL-1β，再分泌到胞外空间。
TLRs如何转导信号导致caspase1和IL-1β的激活？这一过程还不清楚。TLRs是细胞表面受体，特征是胞外的富亮氨酸区（LRRs）和胞内的toll/IL-1受体（TIR）区（图1）。TIR区是一个保守的蛋白-蛋白作用模块。它在两个胞膜调节蛋白沙锅内也有表达。它们是MYD88和TIRAP，与TLRs的TIR区相作用。TIR区对信号转导是十分重要的，而胞外LRRs主要功能则是识别PAMP。例如，TLR4的LRRs和LPS结合而flagllin则与TLR5的LRR作用。
CATERPILLER蛋白家族
然而TLRs并不是人体防御蛋白中唯一具备LRRs域的。人类基因组序列的完成使得胞内LRR包含蛋白的新家族的发现成为可能，而且也有越来越多的证据表明它们参与了宿主的防御反应。它们与TLRs和植物防御蛋白不同的是不具备TIR区，但除了C端的LRRs外还有三个不同的区域：所谓的NACHT区（在神经凋亡抑制蛋白中出现的区域），MHC II的反式作用子（CIITA，HET-E和TP1），caspase-recruitment区（CARD）或pyrin区（PYD，Box1）。这一家族最近被命名为CARTERPILLER基因家族。本文综述了多个亚家族并重点说明NALP亚家族。
NACHT区包括七个不同的基序，其中有ATP/GTP酶特异性P环和Mg2+结合区。NACHT区与凋亡蛋白酶激活因子（APAF-1）的核酸结合区--称为核酸结合的ARC区（NB-ARC）--具有同源性。NB-ARC可结合dATP/ATP，使APAF-1产生细胞色素c依赖性的寡聚化从而诱导caspase9前体的激活。所有CARTERPILLER家族的NACHT区都应该与ATP结合，但CIITA例外，它与GTP结合。
LRRs是一个20-29个残基序列的区域，在许多具有分化功能的蛋白上都有。LRRs的可能功能是为病原或细胞内物质之间蛋白-蛋白或蛋白-糖/脂的相互作用提供支架。因为TLRs的LLR能与多种细菌物质结合，包括脂多糖，可以推测下述多种分子中的LRRs在监测病原衍生分子中起到了作用。
数据库检索表明许多蛋白质包含NACHT域：LLRs和CARD或PYD。分析NACHT的序列和功能发现CATERPILLER家族能分为多个亚家族--CIITA，NOD，IPAF和NALP。它们明显地区分具有N端PYD和或CARD的蛋白，暗示LRRs/NACHT获得N端蛋白-蛋白模块后才分化。CATERPILLER家族的另外三个成员分别处于染色体的16q13，16p13和Xq22位（表1），但本文不加以讨论，因为它们并不具有N端的CARD或PYD。
CIITA亚家族。CIITA是激活MHC II基因转录的信号分子。CIITA基因产物的至少三种功能形式是从三个不同的启动子转录来的。包含CARD的那一种在DC细胞中特异性表达。NACHT域内核酸结合区的失活和LRRs缺失均导致自身连接和功能的损伤。
NOD亚家族。NOD1和NOD2因为与凋亡调节子APAF-1有结构同源性而得到确认。它们在NACHT/LRRs之外都有一个功能不清楚的区域，称为NAD（NACHT关联区）。NOD1和NOD2结构上的不同在于它们的N端分别有一个（NOD1）和两个（NOD2）CARDs。NOD1和NOD2的过度表达会诱导NF-kB的激活，这需要CARD的参与，并且与NOD1和CARDs包含的，受体介导的丝氨酸/苏氨酸激酶RIP2的结合能力相关。NOD1和NOD2似乎都介导对LPS的反应，因为NF-kB外源弗氏痢疾杆菌或胞内LPS诱导的激活能被NOD1的dominant-negative version阻断。所以，除了TLR4介导的胞外LPS敏感系统之外，哺乳动物细胞还有一条检测胞内LPS的路。
NOD2定位与染色体16q12.1，与IBD有部分重合。这一位点被发现与Crohn's肠炎易感有关。NOD2基因突变提高对Crohn's肠炎易感性的机制还不明白。此外，NOD2的NACHT区点突变后出现Blau综合征--一种常染色体优势的性状，患者容易感染支气管炎、葡萄膜炎和皮疹。
IPAF亚家族。IPAF含有一个氨基端CARD，一个中心NACHT和一个C端LRRs。但它缺少NAD，因此与NOD1和NOD2不同。据报道IPAF与caspase-1以及多种CARD蛋白有关，还能激活caspase-1过度表达，表明IPAF-1参与了炎症过程。
即使不具有CARD或PYD，NAIP也属于这个家族，因为它的NACHT和LRR区具有高度的序列相似性。代替CARD和PYD的是NALP氨基端的三个杆状病毒凋亡抑制重复序列，它们能抑制caspases。NALP突变与脊髓性肌萎缩有关。小鼠体内NALP主要表达在巨嗜细胞中，由许多高度同源性的基因Naip1-Naip7编码。Naip2或Naip5与Lgn1有关，这个位点能够促进巨嗜细胞识别嗜肺军团菌。
LRRs似乎对IPAF有自主抑制功能。去除LRRs能使蛋白质激活。所以可能有潜在的蛋白激活剂与LRRs结合后导致LRRs灭活而IPAF和NALPs激活。虽然IPAF是caspase的激活剂，但NALP抑制caspase活性，可以推测这一蛋白酶-蛋白酶抑制对因其功能拮抗均参与了反应。
NALP亚家族。NALPs包括14个成员，是CATERPILLER蛋白中的一大类亚家族。它们的特征是氨基端的PYD。NALPs2-14均可发现这种结构模式，但NALP1不同，它还有一个附加区FIIND（功能未明）以及形成C端延伸的CARD。除了两个明显的异常NALP1和NALP3之外，其它NALPs主要定位于染色体的11p15（NALPs6，10，14）和19q13.4（NALPs2，4，5，7，8，9，11，12和13）（表1）。有趣的是，11p15.5区是一个很重要的特征区域，与Beckwith-Wiedemann综合征紊乱以及许多人肿瘤有关。
Figure 2 | Domain structures of NALPs and subfamilies of the CATERPILLER protein family. For comparison, the modular structure of APAF-1 is shown. AD, activation domain; APAF-1, apoptotic protease-activating factor-1; BIR, baculovirus IAP repeat (where IAP stands for inhibitor of apoptosis protein); CARD, caspase-recruitment domain; CIITA, class II transactivator; FIIND, domain with function to find; IPAF, ICE-protease activating factor; LRRs, leucine-rich repeats; NAD, NACHT-associated domain; NAIP, neuronal apoptosis inhibitor protein; NB-ARC, nucleotide-binding APAF-1, plant R gene products and CED-4 domain; NOD, nucleotide-binding oligomerization domain; PYD, pyrin domain; WD-40, WD-40 repeat region. Also see Box 1.
Table 1 | The CATERPILLER family
NALP亚家族成员
NALPs因为是最近才发现的，有关它们的功能、表达以及结合的物质都还不清楚。我们的知识大部分来源于NALP1，3，5。所以我们将更详细地讨论NALP1，3，5。
NALP1. NALP1也称为DEFCAP/NAC/CARD7，它是NALPs家族中第一个因为与APAF-1的序列同源性而被确认的。NALP1是家族中唯一一个具有C端FIIND和CARD的。有趣的是，已经有一个已确定的蛋白质--称为CARDINAL，拥有能够和C段的这一序列特异结合的区域，而且它在多种肿瘤中过度表达。CARDINAL多度表达会诱导凋亡，虽然据报道它也有抑制caspase9/细胞色素c诱导凋亡以及抑制NF-kB活化的作用。
NALP1最初被发现能够诱导凋亡，可以通过直接与caspase2,9结合，也可以间接与APAF-1反应从而激活凋亡功能。最近越来越多的研究发现内源性NALP1在前炎症caspase的激活中有重要作用。NALP1有四种变体，其中一种不含有CARD。心脏、胸腺、脾脏、肾脏、肝、肺和外周血淋巴细胞均有NALP1的mRNA。
NALP3. NALP3也称PYPAF1/Cryopyrin/CIAS。它与PYCARD/ASC结合并激活caspase1和NF-Kb。它只在淋巴细胞上表达。已发现三种变体，其中一个缺乏所有的LRRs。NALP3基因突变与自身免疫性疾病有关，这表明它在炎症中具有重要作用。
NALP5. NALP5也称PYPAF8/Mater，而且已用小鼠进行了广泛的研究。与人源NALP5的PYD不同，小鼠Mater的氨基端难以确定。Mater在小鼠自身免疫模型中可作为自身抗原。Mater敲除小鼠在胚胎期即会死亡，表明Mater对细胞活性有重要作用。
Figure 3 | The inflammasome. When NALP1 is activated by an unknown factor, a complex composed of NALP1, ASC/PYCARD, caspase-1 and caspase-5 assembles, which brings the caspases in close proximity, thereby activating them. CARD, caspase-recruitment domain; LRR, leucine-rich repeat; PYD, pyrin domain; NACHT, domain present in neuronal apoptosis inhibitor protein (NAIP), major histocompatibility complex (MHC) class II transactivator (CIITA), HET-E and TP1.
NALPs的功能
NALPs的功能是什么？起初认为和凋亡有关，因为NALP1能和APAF-1、Caspase9结合使它们过表达。其它研究表明NALPs在控制NF-kB通路中有作用，虽然目前还不知道NALPs是激活通路还是作用于抑制子。
ASC/PYCARD的启动. NALPs的一个确定特征就是能够通过PYD-PYD作用与ASC结合。ASC能够表达22kD的蛋白质。它具有一个C端CARD和一个氨基端PYD，因此适合于作PYD-和CARD-包含蛋白之间的调节子。值得注意的是，一个与ASC有高度同源性，但缺乏CARD的蛋白质，在染色体16位上与ASC相邻。我们称之为ASCI而且发现它能够抑制ASC的功能。ASC和NALPs之间的作用以前是在NALP1上发现的，现在发现NALP2、NALP3和NALP12都有--不过这些作用还有待商榷。
ASC最初是作为一种去污剂不溶解的蛋白而不发现的，它在细胞内形成钨丝结构，参与视黄酸诱导的凋亡。ASC过度表达会形成ASC复合物和钨丝结构，虽然还不太清楚这些结构的显著作用。许多上皮细胞和白细胞、毛囊、外周血淋巴细胞都充分表达ASC免疫组化研究表明在严重的炎症部位中性粒细胞表达ASC升高。ASC表达也有基因水平的调节，这是通过增强子甲基化实现的。已证实在人乳腺癌细胞中ASC/TMS1会有异常甲基化或沉默。
前炎性caspase的激活. ASC的PYD区与多种NALPs的PYD区相互作用，而ASC的CARD活化caspase的CARD区。前caspase1能够诱导激活前IL-1β。IL-1β是由活化的巨嗜细胞和单核细胞产生的。它以非活化形式存在，要在116位天冬氨酸处切开才能成为成熟形式。如前所述，caspase-1作为IL-1β转化酶介导了这一反应。Caspase-1是炎症蛋白caspases家族的一员，该家族全部拥有氨基端CARD。
最新的成果使得我们可以进一步了解前炎性caspase激活的分子机制。有证据表明CATERPILLER家族，尤其是NALPs亚家族是这一信号通路中的重要因子。IPAF的CARD区直接与procaspase-1的CARD结合，当它过表达时就能够激活caspase-1。NALP1的CARD与另一个前炎性因子caspasse5相互作用。再加上结合并激活caspase1的ASC，就组成了炎症小体。炎症小体包括NALP1、ASC和前炎性caspase1、5，它能够介导活性IL-1β的生成。
有趣的是，caspase1和caspase5也能形成异体复合物。以前曾报道小鼠caspase1和caspase11(可能相当于人casepase4和caspase5)能相互作用，而且也有基因证据表明这两个因子在IL-1β和IL-18形成中的作用。此外，IL-1β发生过程在caspase1和caspase5共同激活的情况下最有效率，表明在人体内和在小鼠体内一样，活性细胞因子的产生有多个前炎性caspase的参与。
炎症小体. 考虑到炎症小体的复杂成分，目前对其结构还知之甚少。NALP1/ASC/caspase1/caspase5在活化情况下组合成约106Da的复合物。ASC是炎症小体的核心成分。如果有ASC的抗体存在或ASC的非活化形式占优势，脂多糖引起的caspase1激活和IL-1β成熟就会被阻断。NALP1是否也是对caspase1的活化起着不可或缺的作用这一点还不清楚，因为提取的NALP1去除的细胞仍有一定的caspase1活化现象。这也可能是其它NALPs或caspase1激活因子如IPAF的作用。我们需要适当的基因敲除小鼠来验证它。
炎症小体中的caspase1和caspase5均以活化形式存在，正如同活化的IL-1β一样，在脂多糖刺激以后释放到上清中。细胞外空间存在炎性caspases这一情况当初是在以电子显微镜观察单核细胞胞浆膜上的caspase1活化是观察到的。其它caspases的释放还未观察到，这可以解释为什么前炎性的caspases一般不是凋亡相关的。活化的前炎性caspases的快速释放可能是前炎性细胞生存所必须的。因此，抑制释放必然导致细胞死亡。而且，当caspase1被胞内IpaB（革兰氏阴性菌产生的一种蛋白）活化以后，前炎性caspases介导的凋亡和活化同时发生了。
NALP1可能会通过它的多个结构功能区在炎症小体的形成中起着核心作用，正如同相关的APAF-1和NOD蛋白一样，NALP1自结合，表明NALP1对caspase1,5的激活和APAF-1对caspase9的激活是一样的。细胞色素c的释放可以激发APAF-1与caspase9的结合，但目前NALP1/ASC的激活还不清楚是如何发生的。推测NALP1的LRRs可以识别PAMPS和/或内源性的"警报信号"如哺乳类的DNA与热休克蛋白之类，然后触发炎症小体形成。一旦细胞结构破坏，即内源性的警报信号释放，就足以激发IL-1β，这一事实与LRRs作为NALP调节单位的推测是一致的。
NALP和caspase-1激活的控制
虽然IL-1β对控制感染是必须的，但过量的细胞因子会损伤宿主甚至致死。因此必须严格调节炎症小体的激活。一个假想的模型推测NALP只有在应激细胞激活或释放的因子与其LRRs结合后才会活化。这一过程依次为蛋白质打开、PYD暴露、ASC结合、caspase-1激活和IL-1β产生。有一个推测，对于NALP3突变的患者来说，对蛋白质的自身抑制受到了损伤，分子可能在不需要激活子的情况下变构。这一不受控制地产生IL-1β的过程可能在体温较低的情况下更适宜发生，这就能解释家族性的寒冷型自身炎症综合征（familial cold autoinflammatory syndrome）患者为什么更容易发烧。如果这个简单的模型能被证实，那么阻断IL-1β就能有效治疗自身炎症。
除了自身抑制之外，炎症小体的激活也毫无疑问有其它多个因素的控制。最近已经证实了多个能干扰IL-1β产生的蛋白质，包括pseudo-ICE/COP和ICEBERG。这两个蛋白是由单链CARD组成的，它们的CARD与caspase-1的CARD有高度同源性。通过CARD-CARD作用，它们就能够通过防止caspase与其调节子的结合来负调控IL-1β的产生。蛋白酶抑制剂9是另一个caspase-1抑制剂，如同ICEBERG一样由前炎性因子LPS、TNF等诱导表达，可能是负反馈通路的一个部分。PI-9通过与caspase-1活性位点结合来抑制caspase-1活化。
NALPs与自身炎症疾病
体内证据表明NALP家族在炎症反应中起着重要作用。最近发现了因NALP3的NACHT区突变而导致遗传性的高热和严重炎症的病人。
遗传性的周期性高热是一类比较罕见的基因型紊乱。它可分为不同的临床亚型，但都存在循环往复的与高热同在的自身炎症表位。其中一个例子是常染色体隐性的家族性地中海高热（FMF），是由于pyrin和marenostrin均有突变引起的。Muckle-wells综合征（MWS）和家族性的荨麻疹（FCU，也称FCAS），则是两种相对的常染色体优势的情况。MWS和FCU/FCAS已被发现和染色体1q44位点相关，这一位点正好落在NALP3的编码基因上。此外，NALP3的多个点突变也在MWS和FCU/FCAS中发现。值得注意的是，NALP3的这些突变都集中在高度保守的NACHT区。有趣的是，pyrin和marenostrin的氨基端PYD会与ASC53作用而可能抑制caspase-1激活。因此，炎症小体信号通路上的任一个突变都可能导致MWS、FMF或FCU/FCAS。
与NALP3突变有关的疾病并不仅限于MWS和FCU/FCAS。在慢性婴儿期皮肤关节综合征（CINCA）患者也发现NACHT区有不同的突变。CINTA表型十分独特，它的特征包括无菌性脑膜炎、中枢萎缩、知觉性聋以及optic disk involvement。
最后发现Blau综合征也是由NOD2的NACHT区--相当于NALP3的R260W--突变引起的。它是常染色体优势的疾病，特征是滑膜炎、关节皮肤肉芽肿以及颅神经障碍。以往有报道说NOD2的突变也会导致Crohn'肠炎，这被发现是NOD2的LRRs发生了突变。
结论和展望
NALP系统的发现为我们研究前炎性caspases的激活提供了新的途径。但是我们对于NALP包含复合物--炎症小体的了解还太少。关键之处是确定NALPs的激活子。因为炎症小体是细胞破裂时产生的，所以至少有一个活化分子是细胞产物。与染色体释放触发APAF-1激活的细胞色素c相似，激活子可能在正常的、非破坏、非应激的细胞中也是位于细胞器中。模型推测细胞器的破裂导致该因子的释放并引起NALP激活。然而，也可能是NALPs的LRRs与病原体的PAMPs结合。所以，NALP可以被认为是胞内的'TLRs'，作用于先天免疫系统，参与侦察胞内的异源物质。考虑早NALP3突变与多种自身炎症疾病的联系，对NALPs激活机制的了解将有助于产生对这些疾病的新的治疗思路。
原文
http://www.nature.com/cgi-taf/DynaPage.taf?file=/nrm/journal/v4/n2/full/nrm1019_fs.html
