华中科技大学同济医学院免疫学系 袁晓梅 曹利民 译
二十多年以来,MIF一直被认为是一个神秘的细胞因子。近几年来,MIF被认为是充当固有性免疫中枢的调节因子这样一个重要的角色。MIF是宿主抗微生物防卫系统和应激反应中不可缺少的成员,而抗微生物防卫系统和应激反应可激发免疫细胞炎症反应前的功能。越来越多的文献表明,MIF涉及败血症、炎症和自身免疫性疾病的发病机制。这些都显示了在未来,以MIF为方向的治疗可能为人类疾病提供新的治疗机会。
感知和清除入侵微生物是一切生物生存所必须的。遗传性缺陷导致的区分自己和非己的失败,于其所致的使易感个体倾向于无限制的微生物入侵和严重的感染一样严重危及生命。天然的宿主抗微生物防卫由固有性免疫系统介导--免疫系统两种类型中最原始的。固有性免疫系统中的哨兵细胞首先执行侦察病原体的任务,例如分布在体表屏障组织的巨噬细胞、树突状细胞,然后依靠循环中的粒细胞和单核细胞迅速招募到感染部粒细胞和单核细胞迅速招募到感染部甘露聚糖结合凝集素(MBL)激活途径以及急性期蛋白、胚系编码模式识别受体(如CD14、TLRs)等相互协调。保存的微生物分子基序,众所周知的病原体相关分子模式(PAMPs)结合到上述这些受体,则激活信号转导途径和免疫基因的转录,结果将导致大量免疫调节分子释放到细胞外环境和协同刺激分子在细胞表面的表达。在这些效应分子中,细胞因子发挥最基本的作用。它们启动宿主炎症反应,协调细胞和体液免疫应答,在数分钟至数小时只内,或者清除或者包围入侵的病原体。在编码细胞因子或细胞因子受体的基因突变或缺失的动物,对感染易感性增加,这为支持细胞因子或细胞因子受体依赖的信号途径调节宿主抗微生物防卫反应发挥重要作用提供了有力的证据。然而在败血症或感染性休克的病人中,不良调节产生的炎症前介导因子可能同样危及生命,表明细胞因子产生应受到严格的调节。
早在四十年前在迟发型超敏反应的研究中发现,MIF是最早被识别的细胞因子之一。然而MIF确切的生物学活性一直都不清楚,一直到1989年人MIF互补DNA的克隆。在1991年,为寻找新的炎症调节因子而导致了MIF的重新发现。MIF与激素相似,当垂体前叶细胞暴露于内毒素脂多糖(LPS)后,就会释放MIF分子。这个有趣的报道显示MIF是联系内分泌和免疫系统的中介因子。1999年诞生的Mif基因剔除小鼠,报导其正常并无明显缺陷。在这篇文章,我们考察MIF的主要特性和生物学行为,研究重点放在最新形成的概念--MIF作为固有性免疫和炎症反应的调节因子发挥中枢性的作用和MIF可为治疗败血症和其它炎症性疾病带来新的发展。
MIF基因和蛋白的结构
在人类基因组中,只有一个MIF基因位于22号染色体长臂(22q11.2)和小鼠10号染色体Mif基因部分同线保守。在小鼠基因组中至少发现有9个假基因。在人类基因组中寻找MIF的同源基因,显示D-多巴色素互变异构酶(DDT)基因是唯一和MIF同源的 。这两个基因都位于22号染色体,距离较近。有理由推测,MIF和DDT基因是同一个原始基因的拷贝,在不断进化中,演变成或具有不同生物学功能。两种MIF基因的多态性同人类疾病有关。一种是在5ˊ侧翼区单核苷酸突变(在---173处G→C)和全身发作型幼年期关节炎有关。另一种多态性CATT四核苷酸在-794处重复,一部分病人比较严重的风湿性关节炎与此有关联。
在人类、小鼠、大鼠各种种系中发现,单个MIF信使RNA约0.8Kb。它编码114个氨基酸组成的无糖基化的分子量为12.5KD的蛋白质。所有哺乳类动物的MIF基因(包括人、大鼠、小鼠、牛)大约有90%的同源性。MIF也就是糖基化抑制因子(GIF),报道称,它能抑制IgE的合成,并且它具有特异性抗原抑制因子的活性。令人惊奇的是,MIF并不属于任何一个细胞因子超家族。哺乳动物MIF同样也和有颚、无颚的鱼类,蜱,寄生虫,某些植物和蓝细菌等有同源性。物种间MIF的保守性显示了MIF可能有重要的生物学功能。
人和大鼠MIFX射线晶体结构显示,它是一个同三聚体,它的三维立体构象与草酰乙酸丁烯酸酯互变异构酶,5-羧甲基-2羟基粘康酸酯酶,分支酸变位酶相似。MIF可以介导DTT,苯丙酮酸烯醇酮异构酶以及硫醇蛋白氧化还原酶类活性。氨基端的脯氨酸残基对接触反应活性很重要。然而,MIF的功能性酶活性是否是它生物学功能所必需的这一点还尚未清楚,可能MIF的酶活性是MIF、DDT基因的原始基因残留的功能。然而,例如氨基端脯氨酸残基进化过程中保留这种情况并不支持上述的假说。
MIF的表达形式 首先,免疫系统中T细胞是产生细胞源性MIF的主要细胞,然而单核细胞、巨噬细胞、血液中的树突状细胞、B细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞也表达MIF。和大多数细胞因子相比,MIF组成型表达并贮存在细胞内池中,因此并不需要在分泌前重新合成蛋白。和IL-1、成纤维细胞生长因子等相似,MIF在氨基端缺少领头序列,表明它是经非传统型蛋白分泌途径从细胞释放的。除了免疫系统,MIF的组织分布很广。值得注意的是,细胞或是组织表达MIF,如肺、皮肤上皮层、胃肠道、泌尿生殖道,和宿主自然环境直接相关。MIF的另一个与众不同的性质是,一些内分泌系统的组织可以高水平表达,特别是那些和应激反应有关的器官,如下丘脑、垂体、肾上腺。
MIF的行为方式
MIF受体 细胞因子通过与靶细胞表达的相应受体结合发挥作用,从而激活信号转导途径,基因转录以及下游效应分子的表达。支持MIF行为方式是通过与一个典型细胞因子受体相互作用而介导,发现MIF能激活细胞外信号调节激酶1(ERK1)∕ERK2--有丝分裂原激活蛋白激酶(MAPKs)家族的成员。有报导,MIF能和CD74细胞外域结合,CD74为MHCⅡ类相关恒定链(Ⅱ型膜分子)。ERK1∕ERK2的激活,细胞增殖,PGE2的产生需要CD74的参与,MIF才能发挥活性。不管CD74是继MIF受体之后要长期探索的,还是它是一个剪短的分子涉及提呈MIF给至今未证实的受体,这些在目前都不清楚。CD74的细胞内域并不含有和信号转导分子相互作用的基本结构这将支持后者的可能性。
MIF激活ERK1∕ERK2信号 对细胞内信号事件和MIF刺激静止的成纤维细胞增殖的研究表明,MIF诱导快速(约30分钟)和持续的(超过24小时)磷酸化和ERK1∕ERK2-MAPK途径的活化和细胞的增殖。MIF诱导的ERK1∕ERK2活化是蛋白激酶A(PKA)依赖的,并且和细胞质磷脂酶A2(PLA2)酶活性增加有关。PLA2是活化炎症前串联反应重要的细胞内联系者。首先它使花生四烯酸生成,然后前列腺素(PGs)和白三烯(LTs)的生成。PLA2同时也是糖皮质激素抗炎效应针对的靶子。ERK1∕ERK2介导的PLA2诱导作用也是MIF能够躲避类固醇类激素免疫抑制效应的一个机制。
MIF上调TLR4的表达 巨噬细胞组成型表达一种细胞因子并不寻常,引起兴趣,由此提出这样一个问题:即MIF高基线水平的表达对巨噬细胞有什么好处呢?对转染反义MIF结构的巨噬细胞和从Mif基因缺失小鼠分离的巨噬细胞的研究给上述问题提供了答案。实际上,TLR4表达下调而使细胞因子生成减少时,发现Mif缺失的巨噬细胞对LPS和Gˉ细菌低反应,但并不涉及对其它刺激低反应。TLR4-LPS受体复合物的信号转导分子。MIF上调TLR4的表达是通过对转录因子的ETS家族作用而实现的。ETS家族包括PU.1,它对小鼠Tlr4基因的转录很重要。因此,MIF促进了对含内毒素细菌的侦察,使位于宿主抗微生物防卫系统第一线的细胞,如巨噬细胞,能迅速对入侵的微生物起反应。炎症前细胞因子的快速生成对于宿主防卫反应的产生是绝对重要的。与此相一致的是,最近报导,Mif缺失小鼠不能控制胞内菌(鼠伤寒沙门菌)的生长,对感染无能为力。Mif缺失小鼠易感性的逐渐增加而致感染和血浆水平细胞因子如TNF、IL-12、IFN减少有关,但和NO无关,且与野生型小鼠相比,细菌数量较多。这表明MIF促进TH1细胞对鼠伤寒沙门菌的保护性免疫应答。综上所述,这些资料为与外环境紧密接触的表皮屏障细胞与组织组成型表达MIF提供了合理性依据,而且也提供了Mif缺失小鼠对致死性内毒素血症抵抗的机制。
MIF抑制p53活性 原始的肿瘤和众多肿瘤细胞高水平表达MIF。最近报道显示MIF作为p53介导生长抑制和凋亡的负性调节因子的功能。这给MIF,炎症,细胞生长和肿瘤发生之间提供了有趣的关联。根据这份资料,报导称,和野生型细胞相比,在LPS攻击后,MIF缺失巨噬细胞炎症前的功能(指TNF、IL-1β、PGE2的生成)和生存能力将降低。尽管,MIF缺失巨噬细胞和野生型巨噬细胞生成相同水平NO。NO被认为是LPS刺激MIF缺失巨噬细胞逐渐凋亡的重要介导因子。实际上,发现MIF能抑制NO诱导的细胞内p53的积聚,因此也就抑制了p53介导的凋亡。MIF对p53的抑制需要一系列ERK1∕ERK2、PLA2、环加氧酶2(COX2)、PGE2的活化。与这些结果相一致的是MIF被报导称,与E2F-p53途径交互作用来维持正常和恶性肿瘤细胞的生长。因此上调TLR4的表达和维持细胞存活是MIF促进炎症前固有性免疫应答的两个机制。
MIF抑制JAB1活性 运用酵母双杂交系统,可以看到MIF与JUN-活化结合域蛋白1(JAB1)或者叫作CSN5蛋白的交互作用。JAB1激活JUN-N端激酶(JNK),磷酸化JUN。所以作为激活因子蛋白1(AP1)的协同激活因子而发挥功能。AP1是参与细胞生长,转化和细胞凋亡 的转录因子。JAB1的其它功能包括细胞周期抑制因子KIP1和肿瘤抑制因子p53的退化。MIF和JAB1共同存在于细胞质中,MIF抑制JAB1对JNK、AP1活性的正性协调效应。
这个报导有另外两个引人注意的理由,第一,它表明细胞可以通过内吞作用来摄取MIF。既然细胞中有大量表达的MIF,那么细胞为何宁愿通过内吞摄取MIF而不用细胞内的MIF,这样有何好处呢?MIF内吞作用可能通过受体依赖或受体非依赖方式发生。因此,明显不同的可能是,MIF的内吞诱导了细胞活化,而未经加工处理的细胞内MIF不能诱导细胞活化。乍看,内吞对于经典的细胞因子来说并不是典型的行为方式,然而这并不必然意味着MIF的内吞可以绕过与MIF直接相互作用的膜受体的必要性。实际上,有许多例子说明了内涵体参与了配体活化细胞因子受体介导的信号转导,如转化生长因子β(TGFβ)受体。第二,Kleemannet al.的文章把生长抑制和抗炎功能归因于MIF。着违反了我们通常认为的MIF的两个很明确的特性--它维持细胞生长和诱导炎症前应答的功能。对MIF研究侧重点的不同或所处细胞状态不同(静止的或是活化的)而得出不同的结论,可能是这些报导结论相矛盾的原因。
MIF和固有性免疫
最初起初MIF被认为是一个适应性免疫系统T细胞细胞因子。MIF作为一个细胞因子的出现在固有性免疫系统中有着重要的作用。内毒素和Gˉ细菌 内毒素是Gˉ细菌主要毒力因子之一。当LPS刺激时,巨噬细胞就释放MIF,其它的免疫细胞的炎症前效应分子,例如TNF、IFN-γ,同样也是巨噬细胞产生MIF强烈的诱导因子。当MIF释放到组织或在全身循环时,它就充当一个经典的炎症前细胞因子,通过巨噬细胞、T细胞活化而促进固有性和适应性免疫应答。
虽然MIF对抗感染是必需的,但高水平的MIF生成在急性感染中是有害的。虽然单独注射MIF并不诱导休克,但高剂量重组的MIF和LPS或E.coli协同注射入小鼠,可以加剧致死性内毒素血症和大肠埃希菌败血症。在败血症小鼠的组织和循环中发现有高水平的MIF。中和MIF的特异性抗体可降低TNF的生成,同时保护小鼠免遭E.coli或盲肠结扎穿刺术(CLP)诱导的致死性内毒素性休克或败血症,即使是当细菌性腹膜炎已发作后才开始MIF特异性抗体的治疗。
使动物对败血症能幸免一死这种能力很重要。当给予的处理是治疗性的而不是预防性的,因为对于抗败血症的治疗,从定义上说,通常是在人类感染发作后才给予的。概括上述一些发现,Mif缺失小鼠报导说能抵抗内毒素性休克。虽然使用一个不同Mif基因靶向方向而产生的Mif缺失小鼠开始时报导称和野生型小鼠对LPS一样敏感。但是另一组研究者后来额外所做的实验显示这些Mif缺失小鼠对LPS抵抗。
外毒素与G+细菌 40%-50%的败血性休克是由G+细菌引起的。葡萄球菌和链球菌的充当超抗原的外毒素和细胞壁的成分(如肽聚糖、脂磷壁酸)可以通过刺激巨噬细胞和T细胞释放炎症前介导因子而诱导休克。MIF参与了G+败血症的发病机制。小剂量的葡萄球菌毒性休克综合症毒素1(TSST-1)或链球菌致热外毒素A(SPEA)诱导巨噬细胞产生MIF。这促进了致死性炎症前反应,中和MIF特异性抗体的给予可以降低小鼠死亡率。在Mif缺失小鼠身上开展的实验证实,Mif的缺失和对由葡萄球菌肠毒素B引起的G+休克的抵抗力逐渐增加有关。不耐热的肺炎链球菌刺激也可致全血中的细胞释放MIF。MIF特异性抗体减少细胞因子产生,增加肺炎链球菌感染小鼠肺炎的存活。综合内毒素血症和Gˉ败血症的实验,这些资料表明MIF在细菌感染的发病机制中由重要作用。
MIF和宿主对其它病原体的反应 除了细菌性败血症,MIF还涉及寄生虫性(疟疾、囊虫病、利什曼病)和病毒性(巨细胞病毒和流感病毒)感染的发病机制。小鼠感染利什曼原虫后,其淋巴结产生MIF.在体内实验中,给予重组MIF可降低感染的严重性,缺失Mif的小鼠比野生型小鼠对利什曼病和囊虫病更加易感。感染了疟原虫的红细胞的吞噬作用或者通过巨噬细胞摄取疟疾色素(疟原虫色素)都可诱导MIF的释放。MIF抑制红系、粒巨噬系多能分化祖细胞来源的集落形成,提示它能参与疟疾性贫血的病理生理过程。在妊娠妇女,其胎盘感染了疟疾,绒毛血中单核细胞MIF生成显著上调。
MIF和炎症
越来越多的证据支持这样的概念--MIF是宿主炎症反应不可缺少的组成成分。根据上述的总结概括,当免疫细胞被暴露于微生物产物或炎症前细胞因子或在特异性抗原活化时,就会很快产生MIF。且MIF具有有力的自分泌或旁分泌效应,促进细胞生长和存活。用MIF缺失细胞,特异性MIF抗体或重组MIF做实验,研究人员得出MIF直接或间接促进一组炎症前分子包括细胞因子(TNF、IFN-γ、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8)巨噬细胞炎症蛋白2,NO,COX2和花生四烯酸途径产物的生成和表达,还有一些基质金属蛋白酶和它们的抑制因子。
一份令人奇怪的报导,起初它的内容和MIF这种细胞因子炎症前特性并不相符。它报导糖皮质激素诱导而不是抑制MIF的分泌。然而这个看似荒谬的发现实际上帮助确定了MIF的重要生物学特性。事实上,发现MIF能躲避糖皮质激素的免疫抑制效应。体外实验中,观察到糖皮质激素诱导的对外周血单核细胞合成TNF、IL-1、IL-6、IL-8的抑制,对细胞质PLA2的活性的抑制,对成纤维细胞释放花生四烯酸和对T细胞增强的抑制都能被MIF所逆转。MIF的这种反向调节效应,在小鼠内毒素血症和抗原诱导的关节炎实验模型中已得到证实。和糖皮质激素相似,在炎症,感染,应激中,循环中MIF的浓度会增加。
分析MIF和糖皮质激素相互作用的分子机制,发现MIF对糖皮质激素的干扰发生在转录及转录后水平。Daun和Cannon指出,MIF能对抗氢化可的松对核因子-κB(NF-κB)的效应,是NF-κB信号转导途径的抑制因子。它通过对抑制蛋白IκBα的类固醇介导的诱导作用起反作用。在这些资料的不断证实核延伸中,我们最近发现,MIF抑制糖皮质激素在转录及转录后对细胞因子产生的调节。越来越多的文献支持,正在形成这样一个概念--MIF充当糖皮质激素活性生理性的对抗者,并且MIF和糖皮质激素共同调节固有性和适应性免疫应答。近来的研究涉及MIF在人类和实验模型中慢性炎症,自身免疫性疾病的发病机制。这些进一步阐述了上述的概念。
MIF和适应性免疫
虽然MIF是作为一个被激活的淋巴细胞释放的因子而发现的,但至今关于它在适应性免疫中的作用知之甚少。T细胞组成型表达MIF.有报导,丝裂原、破伤风毒素、CD3特异性抗体、TSST-1和糖皮质激素均可刺激T细胞或小鼠脾细胞释放MIF。虽然MIF被认为主要是由TH2细胞产生的,但它也可由TH0、TH1细胞产生。MIF可能通过内分泌循环起作用,维持T细胞的活化和增殖,IL-2的产生。MIF特异性抗体超抗原诱导的活化和脾细胞的增殖,借以进一步支持MIF同样也是一个淋巴样的细胞因子。而且,MIF抑制对细胞毒性CD8+T细胞的调节效应。所以MIF在适应性免疫系统中同样有重要的免疫调节功能。
治疗前景
已经表明,MIF参与很多急性、慢性炎症反应的发病机制,包括败血症、急性呼吸窘迫综合症(ARDS)、哮喘、关节炎、肾小球肾炎、炎性肠炎、特异性皮炎、异体移植排斥和现今大多数的动脉粥样硬化。由于这篇文章重点是针对固有性免疫,我们仅以MIF对败血症和ARDS潜在的治疗前景加以讨论。
败血症 严重的败血症和感染性休克是固有性免疫调解障碍引起的急性临床表现。这些危及生命的并发症在美国最常见死因中排第十,在无冠心病重症监护病房ICU最常见死亡原因中排第二。在过去的20年里,对败血症发病机制的了解已经取得了长足的进步。虽然最近在美国一分关于败血症的流行病学调查显示死亡率水平正在下降,但是新的治疗手段的鉴定仍是应最先考虑的事,因为严重脓毒症(20-35%)和感染性休克(50-60%)的死亡率仍很高。
MIF炎症前的固有的特性。固有性免疫细胞高表达MIF,并且它在巨噬细胞对微生物产物应答中发挥重要作用。这些都为支持MIF在败血症中的作用提供了引人注目的证据。这个假设已经在一些中毒性休克和活细菌脓毒症实验模型中得到检验,表明MIF的过量产生在败血症的急性期是有害的。
在患有严重败血症或感染性休克的病人血中可以检测MIF水平的增加,血中MIF水平和败血症的严重性、应激的激素水平(可的松)及细胞因子(IL-6)、急性肺损伤和致命的结果之间的关联已发现,中和MIF活性或剔除MIF基因均可降低炎症前活性和提高存活。使用MIF特异性抗体治疗患有败血症的病人这个临床发展策略目前已经开展。
ARDS 败血症是ARDS最常见的原因。ARDS--最严重的威胁生命的急性肺损伤型式,肺泡上皮组织和微血管内皮的断裂、中型粒细胞和细胞死亡是ARDS所特有的严重炎症反应的重要组成部分。在正常肺组织,支气管上皮组织、肺泡毛细管内皮和肺泡巨噬细胞组成型表达MIF。在患有ARDS的病人,MIF的表达上调,并且MIF扩散入肺泡腔,在肺泡腔增加了肺泡炎症反应。对MIF的免疫中和可降低ARDS病人肺泡巨噬细胞TNF、IL-8的分泌。相比之下,增加重组MIF提高TNF、IL-8等的释放,所以促进了有害的肺炎症反应。MIF和外周血的单核细胞、T细胞被观察到反调节糖皮质激素对从ARDS病人的支气管肺泡灌注液中细胞分泌的细胞因子的抗炎效应。在哮喘--另一个急性肺炎性疾病中,十四烷酸醋酸盐,C5a和IL-5刺激嗜酸性粒细胞可诱导MIF快速释放。在哮喘病人的支气管肺泡灌注液中可发现其已含了高水平的MIF。
结论
近几年来,MIF作为固有性免疫系统中的一个重要的效应因子而浮现。MIF和大多数组织因子不同的是,它在免疫细胞和内分泌细胞固定地表达,它也可由与外环境直接接触的上皮层组织表达。这些表明MIF作为宿主感染和应激反应的调节因子发挥重要作用。和这个假设一致的是MIF被发现能上调巨噬细胞表达TLR4--Gˉ菌内毒素的受体复合物的信号转导分子。微生物产物和炎症前细胞因子诱导预先形成的MIF的释放,从而作为固有性和适应性免疫反应的调节因子发挥作用,MIF独特的性质包括它能反向调节糖皮质激素对免疫细胞的免疫抑制效应,它能通过抑制P53依赖的巨噬细胞的凋亡而维持炎症前的功能,通过它的炎症前和免疫调节属性,MIF促成了严重败血症的发病机制。ARDS和自身免疫性疾病的,MIF的高水平的表达和疾病的严重性、不良结局相关。MIF在固有性和获得性免疫中的重要地位,使MIF活性的药理学或免疫调节可望给患有严重败血症和炎症,自身免疫性疾病的病人提供新的治疗选择。