邵焰 译
韩国生命科学院
简介:LAT最初从活化的Jurkat细胞系细胞膜中纯化到的一种与T细胞活化有关的蛋白质,主要表达于T,NK,血小板和肥大细胞,B细胞和单核细胞不表达。LAT是一种I型膜本体蛋白(integral membrane protein),包括较短的N端胞膜外区、跨膜区和较长的胞浆区。LAT末端有四个酪氨酸残基(Y132,Y171,Y191,Y226)是活性必须的.一个可募集磷脂酶Cγ1 (PLCγ-1)的YXXV基序,三个可募集Grb2、Grap和Gads的YXN基序。跨膜区附近两个半胱氨酸(Cys26和Cys29)是棕榈酰化的位点,使LAT成为脂筏(GEM,raft)结构中的一个重要分子。在TCR参与下,LAT末端酪氨酸磷酸化,招募大量对T细胞激活重要的信号分子。磷酸化的LAT结合三个接头蛋白:Gads 、PLCγ-1、Grb2。1)Gads和SLP-76结合到LAT复合体上,使SLP-76磷酸化。磷酸化的SLP-76结合NcK\Vac对T细胞的肌动蛋白的聚合和帽的形成起重要的调节作用。2)Grb2吸引Sos到LAT复合体上,介导Ras-Raf-MAPK途径。3)PLCγ-1和LAT结合导致磷酸化和脂酶招募GEM(糖脂富含的细胞膜区)激活邻近PI4,5P2活化的磷脂酶。PLCγ-1水解PI4,5P2 生成第二信使Ins1,4,5P3和1,2DAG,从而Ca+移动和PKC的活化。以上三种途径在各种水平上相互关联,促进NFAT,AP-1和NFκB转录活性的激活,导致IL-2 基因的转录。
LAT(T细胞活化连接子)点突变鼠杂合子早期阻断T细胞突变但后来发展为在多克隆淋巴增殖性紊乱和终身免疫疾病征。来自LAT变异鼠的T细胞内,T细胞受体(TCR)诱导的PLCγ-1和NFAT激活,Ca+内流,IL-2产生以及细胞死亡都减弱或消失。相反,TCR诱导的Erk激活完整无缺。这些结果证实,在T细胞发育稳态中,LAT对PLC-γ1 and Ras-Erk信号完整起关键作用。
LAT是一种跨膜支架蛋白。TCR参与后,酪氨酸磷酸化募集大量用于T细胞激活的信号分子。末端四个酪氨酸残基(Y132,Y171,Y191,Y226)是活性必须的.这四个的酪氨酸残基突变将TCR从PLCγ-1-钙和Ras-Erk信号途径分开,引起T细胞发育的完全中断(3-6)。LAT酪氨酸残基优先选择特殊的效应蛋白(3-6)。LAT酪氨酸132残基选择性结合PLCγ-1。表达Y132F(Tyr132突变为Phe)突变蛋白的T细胞株降低了PLCγ-1的磷酸化,减弱或缺乏钙内流(3-5)。当TCR参与后这个突变减弱NFAT活性,也阻断Erk磷酸化(3-5),提示PLCγ-1在T细胞的Ras激活中也许通过Ras-GRP(一个DAG依赖的鸟嘌呤交换因子)起作用(7)。
单个LAT酪氨酸对T细胞发育和功能的重要性被knock in LAT突变所检验,这个在knock in鼠突变等同于人Tyr132(称为Tyr136)突变成苯丙氨酸称为LATY136F (Fig. 1A)。来源于胚胎干细胞的两个独立的克隆被用来建立纯合子突变株来显示相近的表现型。末尾DNA测序证实的LATY136F突变株和在目的等位基因的剩余的编码序列。来自纯合子LATY136F突变鼠的LAT表达在胸腺T细胞约为细胞的一半。相似的诱导表达在LAT+/-(杂合子)和LATWT/WTknock in鼠(表达LAT野生型的knock in模型)。两者在T细胞发育和功能上表现为没有损伤。
分析来自2周LATY136Fm/m鼠揭示严重的但不是完全阻断T细胞发育。来自LATY136m/m鼠的胸腺较小,约为LAT+/+的5~10%。相对于LAT+/+同窝出生鼠含有高百分比的CD4-CD8-胸腺细胞。另外,在LATY136Fm/m,中间状态CD4+CD8+胸腺细胞和成熟的CD4+和CD8+细胞的数目和百分比都明显减少(Fig. 1A and fig. S2) (8).。检查LATY136Fm/m成熟的CD4-CD8-胸腺细胞亚群揭示T细胞发育阻断在CD25+CD44lo/-阶段(Fig. 1A).。因为前TCR信号是CD25+CD44lo/-细胞转变为CD25-CD44l-阶段所要求的,这些结果暗示LATY136F突变株依赖前TCR复合物。
人们观察到老的LATY136Fm/m是一个完全不同的原形。约四周龄时,LATY136Fm/m鼠开始显示胸腺病变和脾肿大(fig.S3)(。淋巴结和脾包含原始的CD4+T细胞和数量增加的B细胞、巨噬细胞和嗜酸性细胞(Fig1B)(9)。来自较老的LATY136Fm/m鼠胸腺较小,也包含高百分比的CD4+ T细胞和的B细胞,这提示它们已经被来自外周淋巴结的细胞所渗透。组化分析显示CD4+T细胞、B细胞、巨噬细胞和嗜酸性细胞多器官渗透(fig.S3)(9)。大多数LATY136Fm/m鼠在六周龄前死去。
由于幼小的LATY136Fm/m鼠有小胸腺和微量成熟的CD4+和CD8+胸腺细胞和T细胞,来自较老的LATY136Fm/m鼠的外周淋巴器官有大量CD4+T细胞的发现暗示这些细胞因繁殖扩张而增加。事实上,来自LATY136Fm/m鼠的CD4+T细胞比LAT+/+的大而且表现为前激活的表现型CD62LloCD45RBloCD44hi(fig.S2)(8). LATY136Fm/m鼠比LAT+/+包含更高百分比的繁殖性的T细胞(Fig1B)。外周CD4+T细胞的TCR的全部展示是多样的(用TCRβ方法检测),这暗示多克隆扩增(9)。来自LATY136Fm/m鼠的CD4+T细胞也抗TCR介导的细胞死亡(Fig1B和figS4),这暗示另一种细胞扩张的可能机制。
来自LATY136Fm/m鼠的T细胞表达低水平的表面TCR(Fig1B)。体外培养数天后,尽管没有达到正常水平,TCR表达增加。除了低表达TCR外,LATY136Fm/mT细胞是CD5 hi(figS2)(8),这是细胞表达高亲合自身配体的TCR的特性(12),胸腺发育异常和相伴随的资料(Fig1A)暗示LATY136Fm/m胸腺选择受损导致自身反应的T细胞存活。
来自LATY136Fm/m鼠的CD4+细胞体外繁殖对CD3抗体低应答,甚至存在C28单抗的共刺激时也如此,相反,它们对PMA和ionomycin或抗CD3和抗CD28抗体加ionomycin应答与LAT+/+T细胞的相似。事实上,ionomycin足够诱导LATY136Fm/m鼠在存在其他刺激时繁殖T细胞(Fig2A)。来自的T细胞也对IL2加TCR刺激应答而繁殖(Fig2A)。因此,LAT136Fm/m鼠的T细胞的体内激活,出现信号途径缺陷,它们有能力产生IL-2对TCR的加入应答。
为了调查LATY136Fm/m鼠的发育和功能异常的分子基础,我们做了一项TCR信号应答的分析。CD4+淋巴结T细胞纯化后用抗CD3和抗CD28抗体共刺激,在LAT136Fm/m鼠的T细胞,那些不依赖LAT磷酸化的(如TCRζ和ZAP-70的酪氨酸磷酸化)近端激活不受影响(Fig3A)。另外,酪氨酸磷酸化的配体蛋白SLP-76结合LAT酪氨酸(而不是通过它与配体Grads结合Y136)不受损(9)。抗体刺激后LAT136Fm/m鼠的LAT和PLC-γ1的磷酸化明显减少(Fig3A)。CD4+淋巴结T细胞和胸腺细胞不能应答CD3加CD4或CD3加交联而动员钙离子,甚至用高浓度的刺激性的抗体孵育时也如此(Fig3B)。CD4+ CD8+胸腺细胞的TCR诱导的钙内流也流产或减弱(Fig3B),它们的TCR表达水平与LAT+/+鼠的相似(9)。TCR交联也不能激活钙依赖的NFAT-c2(figS5)或诱导IL-2产生(Fig2B)。IL-2在TCR加入后增加FasL表达和使细胞对Fas介导的杀伤敏感(14,15)。在体外激活前后,LAT136Fm/m鼠T细胞比来自LAT+/+鼠的T细胞低表面水平表达Fas,而且不能诱导应答TCR参与的Fas表达(figS4)。与这一致,LAT136Fm/m鼠Fas介导的细胞死亡是缺陷的(figS4)。
吃惊的是,与T细胞得到的结论相反,来自LAT136Fm/m鼠的CD4+T细胞和CD4+ CD8+胸腺细胞的Erk激活应答CD3加CD4交联是正常或轻微的减少(Fig3A)。另外,CD3单抗对来自LAT136Fm/m鼠的CD4+ CD8+胸腺细胞的刺激减弱了CD5表达。这个应答已经显示是Ras依赖的(16,17)。这些结果提示LAT136F敲入突变鼠把TCR信号与PLCγ-1-钙依赖的信号分离但不阻断体内Ras-Erk依赖途径的激活。
LATY136Fm/m表型与缺乏 NF-ATc1 and NF-ATc2的鼠有惊人的类似之处。这暗示它促使至少部分地不能激活这些转录因子。在NF-ATc1 / NF-ATc2 / 鼠的CD4+T细胞被激活,T辅助细胞偏倚,以及分泌大量IL-4细胞。为了确定来自LATY136Fm/m的CD4+T细胞是否有TH2细胞因子偏倚,我们分析刺激后细胞的IL-4 和IFN-γ。anti-CD3 plus anti-CD28抗体刺激后来自LATY136Fm/m鼠的T细胞产生很低水平的细胞因子。然而PMA和ionomycin刺激后TCR信号旁路使来自LATY136Fm/m的CD4+T细胞产生比knock-in杂合子或 LAT+/+ mice相对多的IL-4 (Fig. 2B). 与TH2细胞因子一致, LATY136Fm/m鼠的IgG1、E、M血清浓度升高,还有包含大量嗜酸性细胞的多器官渗透(9)。最后,LATY136Fm/m鼠也可以提高DNA和核抗原自身抗体血清水平(fig. S6)。
LAT上的一些特定位点的突变的体内效应揭示了在早期T细胞的发育中PLCr1-Ca信号传导系统的作用。钙的信号对于胸腺中阴性选择的确立是很重要的(19,20)。因此在LATY136Fm/m鼠中正常情况下被阴性选择除去的胸腺细胞可以存活下来并转移到胸腺外周。这些细胞不同于正常的T细胞必须PLC-γ1激活Ras-Erk。在这个观点中,值得注意的是PLC-r1-DAG独立地激活Ras已经在外周血来源的T细胞中被描述了,而且LAT132YF突变的蛋白保留TCR激活后募集Grb2与Ras鸟氨酸交换因子Sos的能力。在LATY136Fm/mT细胞中PLC-γ1低水平的催化就可以足够的激活Ras-GRP或者是蛋白激酶C,从而导致了Ras-Erk的激活。在LATY136Fm/m鼠中由PLC-γ1介导的信号选择性丢失而非Erk信号所导致的T细胞平衡态的破坏进一步表明了对于LAT在结合TCR下游信号中具有重大的作用。