暨南大学 组织移植与免疫研究中心
胸腺是T淋巴细胞增殖主要的部位。但是,直到最近才阐明了能够执行精确的分子间的相互作用机制。尽管已经分离鉴定出了许多起重要作用的分子,这包括可溶性的因子(细胞外间质成分和所有的膜受体以及他们的配体),但是,这些分子在胸腺细胞分化过程中的确切作用需要进一步详尽的阐述。在这一点上,这里要讨论的一种T细胞从干细胞中发育的简单有效的培养系统。这种系统的出现将会大大的简化T细胞发育过程的研究。
众说周知,胸腺有一个独特的性质,就是能够为来源于骨髓的祖细胞发育成T细胞提供一个外部环境。在缺乏胸腺的情况下(无论是先天的遗传缺陷还是通过切除新生鼠胸腺造成的胸腺缺陷),都只能够检测到极少量的外周T细胞,导致严重的免疫缺陷。所以,很明显胸腺为T细胞发育提供了一个适宜的环境,在这种环境下造血干细胞来源的淋巴祖细胞可以发育成为T细胞,而且这种理论在过去的十年里已经成为了T细胞发育的教条。但是,胸腺到底在T细胞发育的过程中提供了什么却不是十分清楚。从一些简单的事实得到了一些线索,那就是尽管T细胞和B细胞具有共同的淋巴细胞祖先,但是他们的发育的过程和在体内的发育场所不同的。B细胞是在骨髓中发育而来的。但是对于T细胞的发育来说,淋巴祖细胞必须离开这种骨髓这种环境进入胸腺才能够发育成为T细胞。更重要的是,B细胞在体外利用骨髓来源的干细胞系很容易繁殖。但是,T细胞的发育需要复杂胸腺器官。许多科学家对T细胞发育的胸腺依赖性已经作出了解释,这些解释引出了这样一种概念,即在胸腺微观构造中特异的基质和上皮细胞环境为T细胞的发育提供了独特的信号。
如图1所示,T细胞进行了一系列明确的分化步骤,这些步骤一般根据细胞表面分子CD4和CD8来划分的:胸腺细胞始于CD4-CD8-双阴性(DN)T细胞,接着变成CD4+CD8+(DP),最后变为成熟的CD4+或者CD8+单阳性T细胞(SP)。DN阶段可以根据表面分子CD25和CD44的表达情况进一步的划分。图1还描述出了胸腺的分区,例如皮质区和髓质区。最近Petrie和他的同事们的研究发现,通过胸腺的分区发现,在胸腺细胞发育过程中,伴随着胸腺细胞在胸腺不同区域中复杂的移动过程。淋巴祖细胞在皮髓质交界处进入胸腺,接着移动到皮质的外部,最后返回髓质。这个过程,包含了许多精细而又同等的选择事件。这个假设性的通过胸腺复杂的有指导性的化学运动已经帮助建立起了一种观念,那就是T细胞的发育需要许多独特的只有在胸腺这个整体环境下才能够发生的相互作用。这一观点进一步得到了Anderson和他的同事们的阐明,在胸腺中不同的STROMAL成分不能孤立,的而只能重新聚集或者组合在一起才能组成一个支持T细胞发育的三维的空间结构。
淋巴细胞繁殖的体外模型
受淋巴祖细胞发育成为T细胞的过程需要完整胸腺这种理论的影响,在体外唯一能够满足这种要求的系统就是胚胎胸腺器官的培养系统(FTOC)。这种FTOC培养系统最早是由Owen和Jenkinson在20世纪80年代提炼出来的。这种FTOC方法提供了一个孤立的可以研究T细胞发育的方法,而且允许在其中进行许多重要的实验性操作。例如,可以预先用去卤氧化物处理胸腺使原有的胸腺细胞消耗一空,而且还允许利用定向的干细胞或者淋巴祖细胞来重新充填这些空的胸腺圆形突出部分。另外,胸腺的基质成分可以被分开也可以分别和祖细胞组合在一起来研究这些成分在胸腺细胞分化过程中所起的作用。最后,FTOC还可以用于其他许多实验方法,例如,可以在其中添加单克隆抗体,逆转录病毒,细胞因子或者多肽。尽管FTOCs的构建很麻烦,而且只局限于有限的细胞,但是在体外没有其他的模型系统能像这种方法能够为T细胞的发育提供一种整体的环境。所以说这种方法是可行的。虽然T细胞的正常发育和分化需要一个完整的胸腺环境或者它的基质成分组合在一起,虽然这个理论已经得到了公认,但是其他的造血细胞系的发育依赖于一个简单实用的培养系统也是事实。
图 1
在一个包含有很多细胞因子半固体的培养基中,能够很早的发现红髓分化的事件。更重要的是,B细胞分化的模型在过去的十年中已经建立起来。在B细胞体外培养系统中主要的成分,包括来自于骨髓的基质细胞系和一些明确的细胞因子。许多已经明确的基质细胞系的特性已经被描述出来,一些已有的特性已经被广泛的利用,例如 Dorshkind等培养出的S17细胞系,在这个领域就得到了很好的应用。其他的基质细胞系也被描述出来,每个都有其独特的性质,尤其是由Kodama和他的同事们研究出的OP9细胞系,似乎也有许多重要的特性,这里将会讨论一下这些特性。
OP9细胞系
OP9细胞系最初来自于骨髓OP/OP小鼠,这种小鼠缺乏巨噬细胞克隆刺激因子(MCSF),OP9细胞最早用于支持早期造血细胞以及其后来源于骨髓HSCs的B淋巴细胞增殖的。Nakano等研究表明,OP9细胞能够支持来源于胚胎的干细胞发育成为造血淋巴细胞。基质细胞能够支持造血细胞的分化,从某种程度上来说是依靠他们所释放的细胞因子来实现的。而且,MCSF支持骨髓细胞的分化。所以,缺乏MCSF的表达导致了OP9细胞可以通过限制ESC来源的骨髓细胞(这些骨髓细胞参与了淋巴细胞的增殖)的克隆扩增来达到支持B细胞分化的目的。我们的研究小组就此作了进一步的研究,提炼出了一套试验步骤,实现了在单层OP9细胞下可以从ESCs中高效的分化出B细胞。更重要的是,许多研究小组,当然也包括我们,研究表明,OP9细胞能够提供自然杀伤细胞(NK)分化所需要的环境。
所以,OP9细胞为诱导从不同来源的祖细胞分化成淋巴细胞提供了切实可行的模型系统。当然,在具有OP9细胞培养的情况下,HSCs可以产生很多的造血细胞系,但是T细胞显然是一个例外。T细胞比率的显著低下是因为T细胞的发育需要一系列的分子与细胞间的相互作用。而这些作用单个基质细胞系是不能够提供的。所以,可以理所当然的得出这样的结论,那就是没有这些基础的相互作用,OP9细胞既不能引发T细胞的产生,也不能支持T细胞的生长。
图2
Notch配体
为了找到缺失的分子相互作用的机制(这种相互作用可能是OP9细胞诱导或者支持干细胞发育成为T细胞的一种重要的相互作用),我们引入了Notch受体和配体基因家族(图2)。许多最近的研究表明,Notch信号在T细胞发育的不同阶段发挥重要的作用。尤为重要的是,Notch信号在决定T-B细胞命运方面起到了关键性的作用。已经明确的一点是,在废除B细胞发育的小鼠中,骨髓祖细胞组成性的表达活化的Notch,而在这类小鼠中CD4+CD8+DPT细胞则发育增殖起来。在补充性的试验中,Notch-1缺限的小鼠则表现出严重的T细胞发育缺限,而且B细胞会在胸腺中发育成熟。这种结果就极大的支持Notch在T细胞发育的早期起重要作用的推断。正如图2所显示的一样,细胞系的定型得到了细胞核中释放的ICN的协同作用,ICN可以改变协同受体和协同活化相关的CSL,导致替代性谱系特异性的转录。此外,在调节TCR-β基因方面,相比较γδ-T-细胞而言,Notch信号更容易促进αβ-T-细胞的发育,影响了CD4+和CD8+细胞的命运抉择。所以这些发现,和最近的报道都支持这样一种观点,既Notch信号在T细胞系定型和分化方面起重要的作用。
因为有力的证据证明Notch受体-配体间的相互作用决定着T-B细胞系转化,而且和骨髓或者胚胎干细胞环境相比较不同的是,Notch配体大量的表达在胸腺微环境中。检测发现无论是OP9细胞表达那种Notch配体,考虑到OP9细胞来源于骨髓而且为B细胞的发育提供了一个极好的微环境,因此,我们有理由相信OP9细胞不表达特异性的Notch配体,因为Notch是T细胞发育和分化所需要的。最初的分析表明,OP9细胞表达可以较早的检测到的锯齿状的基因家族成员,而不是似三角状的基因家族。所以,为了研究OP9细胞异位表达适当量Notch配体是否是导致HSCs从向B细胞的分化途径转变为向T细胞分化,发现OP9细胞确实可以逆向转而表达似三角状的Notch配体-1。
OP9-DL1细胞
尽管Notch-1在T细胞分化中的作用已经明确,但是结合Notch-1以诱导和支持T细胞分化的适当的配体还没有鉴定出来。但是OP9细胞虽然表达锯齿状的Notch基因家族但是并不诱导或者支持T细胞分化的事实表明,三角状Notch家族基因成员可能是其作用的真正因素。这就产生了表达似三角状的Notch家族的OP9细胞(OP9-DL1)。最近报道,OP9-DL1细胞具有两种特性。第一,和对照性的OP9细胞相比较,OP9-DL1细胞失去了支持HSCs发育成为B细胞的能力。第二,OP9-DL1获得了诱导HSCs发育成为T细胞的正常的程序,而且可以诱导 CD4+CD8+DP T细胞和CD8+T细胞的产生。最显著的一点是,在OP9诱导下分化的HSCs被标记发现,他们可以克隆扩增,增加γδ-TCR+和αβTCR+T细胞。而且表达的CD8+T细胞在功能上是完全成熟的。
图3
这些发现粉碎了长期控制免疫领域的一种观点,即T细胞不可能在一种简单单层基质细胞的帮助下从干细胞分化成为T细胞。而且已经确定了这样的一种观点,B细胞和T细胞分化途径的选择依赖于似三角状的Notch分子的交感能力。所以,对于淋巴祖细胞来说它的命运就只是单单的依赖于似三角状分子是否出现在淋巴细胞增殖的微环境中。当出现似三角状分子时就选择分化成为T细胞。但是如果不出现或者是这种Notch分子被修饰了,则会因为三角状的分子的缺席而选择分化成为B细胞。
尽管证据表明似三角状分子1对于细胞系的选择起决定作用,但是和似三角状分子1具有序列同源性的似三角状分子4可能具有类似的作用。而且似三角状分子4也在胸腺表达。所以,适当的Notch配体的表达奠定了胸腺的独特性质,这可能是作为T细胞增殖的起点。但是胸腺外,例如:肠,从某种程度来说也包括脾脏,还有骨髓,在这些器官中,淋巴细胞分化为T细胞是否也部分的依赖于三角状分子的表达尚存在争议。
OP9-DL1细胞的应用
在一种简单的单层基质细胞的作用下,能够分化出T细胞的这种能力不仅有助于回答一个关于T细胞的产生需要分子间的相互作用的基础性问题,而且提供一个研究T细胞发育的新系统。在发现OP9-DL1细胞之前,研究T细胞的发育需要FTOCs。这种FTOCs虽然有效,但是很不实用而且效率相当低。OP9-DL1细胞相当易于培养而且容易增殖。在图3显示了在和OP9-DL1细胞共培养的情况下HSCs发育为T细胞的简单的流程图。
利用图3的实验方法,可以诱导许多不同来源的祖细胞发育成为T细胞。但目前为止,我们已经可以高效的诱导或者说支持分化为T细胞的干细胞有小鼠胚胎肝细胞来源的HSCs,从骨髓来源的HSCs,未分化的ESCs,骨髓来源的淋巴祖细胞,胸腺来源的祖细胞和人Cord血来源的HSCs。当然,这也仅仅是部分罗列。而且祖细胞来源的数量在不久的将来可能会大大增加。值得一提的是,世界上许多实验室已经得到OP9-DL1细胞,而且已经把他们用于自己的实验中。因此,我们很快能够更好的评估在OP9-DL1细胞的诱导下分化成为T细胞的不同来源的祖细胞,而且一系列的分析检测方法和实验方法也将会应用到这个系统中。
在图3中显示了目前适合OP9-DL1细胞共培养系统的不同的应用方法。基于OP9-DL1细胞培养系统的简单性和高效性,其重要的应用就是单个细胞可以被用于研究T细胞祖细胞的功能。尽管这一点利用FTOCs系统也可以做到,但是庞大的分析系统使其可行性几乎是零。另外,利用来源难以计数的干细胞包括ESCs产生T细胞成为可能。这就可以在T细胞发育过程中,删除某些基因,造成一种致死性的表型的方法来研究T细胞发育过程中许多基因的作用特性。更重要的是,通过应用siRNA可以分析一种特定基因的重要功能。例如,在T细胞发育过程中,siRNA能够被早期用于合适的OP9-DL细胞共培养系统。所以和目前应用的FTOCs一起用于研究,可以易化T细胞发育的研究,当然这里所罗列的方法也会继续增加。
尽管利用OP9-DL1细胞共培养方法使得从干细胞发育成为具有功能的T细胞很容易做到,但是这个系统也有一些缺点。例如,OP9细胞不能表达MHC-II分子,而且似乎也不能表达CD1d分子;因此,这就分别限制了对于CD4+T细胞和NK T细胞的阳性选择。但是,OP9-DL1细胞无论被修饰后表达,还是异位表达都需要重新审视他们在分化成为特异性T细胞亚形中的作用。很有趣的是,该系统的另外一个缺点是,限制OP9-DL1细胞的数量,因为这种细胞好像能够向发育中的T细胞提呈自身抗原。例如,和胸腺骨髓上皮细胞形成对比的是,尽管这一点还没有检测但是OP9细胞不可能表达自身免疫受体(AIRE)基因。所以,处理TCR+阳性和或者阴性选择机制的问题可以通过OP9细胞的大量繁殖来进行研究。但是,OP9-DL1细胞恰当的选择TCR+ T细胞的功能或者能力可以通过简单输入 CD4-CD8 -DN祖细胞或者CD4+CD8 + DP T细胞到FTOCs或者输入到宿主小鼠中而被消除。也可以通过干细胞与OP9-DL1细胞共同培养而实现。这种方法不仅提供了一种自身限制性MHC的可行方法,而且为将来把外源性的T细胞输入到体内检测免疫功能提供了一个新的方法。
在体外不同来源的干细胞能够高效的产生T祖细胞的观点为将来许多重要的实验提供了可能性。例如,治疗或者临床上的许多其他方面都用到了这个系统,或者由这个系统起源的其他系统。这种可以在体外从已知的干细胞获得大量T祖细胞的能力为获得性或者遗传的或者是放射治疗或者化疗导致的T细胞性免疫缺陷病创造了新的治疗机会。而且,可以体外创造设计T细胞并把它们用于研究抗原特异性的肿瘤免疫治疗中;或者是体外产生调节性的T细胞用于治疗自身免疫性疾病。在这个领域绝大多数这一类的方法和将来的治疗设想都只是美好的愿望,但是现在有了这种很容易产生T细胞的方法,这些想法变成现实就容易了很多。