黄凤婷 综述
中山大学医学院
摘要:本文就DNA疫苗的免疫机制,注射途径,影响免疫效果的因素,特点,及存在的问题做一综述。
关键词:DNA疫苗;免疫机制;细胞免疫;体液免疫;基因枪;佐剂
1. 引言
随着科技的发展,疫苗技术也在不断进步,从传统的死疫苗,减毒活疫苗发展到近几年十分热门的DNA疫苗。DNA疫苗是指用编码病原体有效免疫原的基因与细菌质粒构建的重组体。用DN A疫苗免疫可有相应的蛋白质表达,表达的蛋白质可在体内诱生特异性体液或细胞免疫应答,也被称为裸 DNA疫苗,因为构成乙醚靠的DNA-蛋白质复合物中只有DNA而缺乏蛋白质。DNA疫苗与传统的疫苗相比,有许多崭新的优点,被称为第四代疫苗。
2. DNA疫苗免疫机制
DNA疫苗常用于表皮,肌肉和静脉接种DNA,均可产生保护性免疫应答。
皮肤接种常用于表皮或皮下接种方式。皮肤及黏膜组织大多首先与外来抗原接触。在皮肤相关的淋巴组织中含有多种 促进免疫应答的专一细胞。其中角质细胞为主要表达细胞。它可产生IL-1,TNF-a,可激活表皮中的APC如树突状细胞,巨噬细胞,朗罕细胞,将摄取和加工处理的抗原转运到淋巴结。这些细胞除可直接摄取和表达质粒DNA外,还可摄取,表达由死细胞释放的外源DNA。在外源基因启动子作用下,使外源基因表达,产物在细胞内水解酶的作用下分解成长短不一的多肽。其中一部分转移至内侄内质网(ER)腔内,与新组装的MHC-I类分子结合形成抗原肽:MHC-I类分子复合物,逼供内提呈给CD8+T细胞,诱发特异性细胞杀伤效应。另一部分转移到溶酶体和内体,经加工处理降解为多肽,与MHC-II类分子形成抗原肽:MHC-II类分子复合物,将抗原提呈给CD4+T细胞,活化的 Th1型CD4+T细胞分泌细胞因子,并使巨噬细胞活化,活化的巨噬细胞能吞噬胞内寄生病原生物,如结核杆菌,麻风杆菌等,也能吞噬所中胞外细菌。活化的Th2型CD4+T细胞分泌IL-4,IL-5,IL-6,IL-10,与 B细胞增殖,成熟,促进抗体生成有关,可增强抗体介导的免疫应答。
骨骼肌细胞是目前所知摄取外源DNA效率最高的组织。但无MHC-II类分子,只表达较少的MHC-I类分子,缺乏共刺激分子B7的专职APC,但非专职APC也可有效地将抗原提呈给T细胞。由 T细胞接受肌肉细胞表达的抗原肽:MHC-I类分子复合物的第一信号,同时接受炎症反应吸引的来自血液免疫细胞所带的共刺激信号而活化。提示抗原提呈与共刺激新并不是要由同一细胞提供,此外,肌肉细胞表达的抗原可通过某些途径转移到专职APC 内,由专职APC将抗原加工处理后,提呈给CD4+T细胞,CD8+T细胞,诱导出细胞免疫和体液免疫。尽管肌细胞本身不足以诱导CTL ,但肌细胞通过表达多种细胞因子,当表达IFN-a,TNF-a时可诱导MHC-I,MHC-II类分子ICAM-1/CD54, LFA-1,LFA-2,LFA-3的表达,由此可诱导产生细胞免疫和体液免疫。
3. DNA疫苗的注射途径
l 直接肌肉注射
注射的DNA在肌肉细胞中以环型分子存在,不能复制,并不能整合到宿主细胞染色体中。肌肉细胞中特有的横管系统与细胞外空间有直接交通,因而可能介导质粒 DNA的内吞作用。而且横纹肌中溶酶体和DNA酶的含量较低,可能也是质粒DNA能在细胞中存在较长时间的原因。
l 微离子轰击介导的DNA免疫
即基因枪。其技术依据是亚微粒的钨和金能自发地吸附DNA,将包裹有金粉或钨粉的 DNA 质粒,借助高能电场以极快的速度轰击动物表皮组织,能获得满意的免疫效果。
4. 影响DNA 疫苗免疫效果的主要因素
接种方式
Leitner等将编码疟原虫环子孢子抗原的质粒通过肌注途径和基因枪介导的表皮途径免疫BALB/C小鼠。研究发现,基因枪皮内接种比肌肉内直接注射的免疫效果要好。免疫效果前者比后者高600-6000倍,且所用DNA剂量也减少。由肌肉注射的100-200ugDNA疫苗减至用0.04-0.4ug纯化的DNAS。
接种途径
Fynan等发现骨骼肌注射接种免疫效果最佳。真皮,表皮,静脉注射效果较好。腹腔内注射效果较差。
接种部位的预处理
Davis等对小鼠免疫前肌肉注射100ul 10mmol/L心肌毒素,然后接种HbsDNA疫苗,结果发现产生抗Hbs抗体水平比对照组高10倍以上。另有实验表明,在注射部位用25%高渗蔗糖进行预处理,可提高疫苗DNA的表达水平。Danko等在接种DNA疫苗前7天注射0.5%-0.75%丁哌卡,是疫苗DNA的表达水平提高40倍以上
接种剂量和次数
研究表明,免疫应答的强度与免疫剂量和次数有一定的关系。DNA疫苗在临床试验的免疫程序一般是3次,Ulmer等报告,给小鼠分别注射1~100ug甲型流感病毒HA或NP DNA疫苗,结果抗~HA和抗~NP水平与接种剂量呈正相关。
免疫佐剂
佐剂种类很多。近几年发现许多细胞因子也具有明显的佐剂效应,例如IL-1,IL-2,IL-6,IL-12,GM-CSF等。Weiner等用包含CpG序列的DNA作为免疫佐剂和一种淋巴瘤抗原共同免疫小鼠,免疫后小鼠能抵抗攻毒试验,且CpG佐剂的毒性比完全福氏佐剂低得多。最近,Rodriguez等利用泛素佐剂将淋巴细胞腺络丛脑炎病毒的核心蛋白(NP)泛素化。泛素化的抗原被快速降解。NP在胞内的快速降解使它不能诱导产生体液免疫。但却提高了它 被MHC-I类分子识别提呈的几率,从而大大提高了CTL的活性。
凋亡信号分子
Shin sasaki等将凋亡信号分子(Capase1 DNA)做简单的突变,减慢凋亡的速度,并把此分子与血红球凝集素和淋巴细胞脉络丛脑炎病毒的核心蛋白(NP)DNA疫苗共表达。结果发现,细胞免疫显著增强。
5. DNA疫苗的特点
DNA疫苗能诱导细胞免疫和体液免疫。
消除导入可能与"减毒"疫苗相关的强毒力病毒的危险性。
使用一次,即能产生长期免疫力,无须增加剂量,并可提高依从性。
多个病原体的基因可装在同一个质粒上,减少了疫时多次注射的不适。
DNA可以干粉形式保存数年,且仍保持起活性。
质粒载体的免疫原性,不会引发针对载体的免疫反应,因而可重复使用或联合使用。
6. DNA疫苗存在的问题
目前,DNA疫苗尚未得到广泛的应用,除了因为它是一种新事物,不大为人所了解之外,它本身的安全问题则是人们对它 的最大顾虑。DNA疫苗存在的问题如下:
外源DNA进入机体后是否整合到宿主基因组,导致癌基因激活或抑癌基因失活。
疫苗DNA长期在体内表达是否会诱导机体产生免疫耐受,长远来说,导致机体免疫功能低下。
疫苗DNA 作为一种外来物质,是否会引起机体产生抗DNA抗体。
DNA疫苗诱导的CTL反应是否会对其他细胞产生杀伤作用。
7. 结束语
DNA疫苗作一种崭新的疫苗,它具有传统疫苗所没有的优点。尽管目前还有问题尚待解决,不过我相信在不久的将来,DNA疫苗会被广泛的使用。