王明永
贵阳医学院微生物学教研室
摘要 幽门螺旋杆菌（helicobacter pylori ；Hp）是慢性活动性胃炎和消化性溃疡的主要致病因子，与胃腺癌和胃黏膜相关淋巴组织淋巴瘤的发生密切相关。Hp在我国和世界上感染十分普遍，人一经获得便可在胃内持续数年乃至一生，从而引起一部分人发病。HP在我国普通人群中发病率较高，感染的年龄也较早，而且随着年龄的增长，HP的感染率及胃癌的发病率同步增长，HP感染者发生胃癌的危险性较非感染者高4-6倍。因此只要预防和治愈了HP的感染，将有可能大幅度的降低消化性溃疡和胃癌的发病率和致死率。与其他感染性疾病一样，免疫疗法有望成为该菌感染的最有效、最有前景的方法之一，因此抗HP疫苗的研究有重大意义。
关键词 幽门螺旋杆菌 热休克蛋白70 DNA疫苗
HP是目前胃肠道感染性疾病研究中最热门的致病菌之一，由于它的存在与消化道多种疾病密切相关，为此人们为清除该菌的感染进行了大量的动物实验和临床研究。目前发现HP的抗原成分：热休克蛋白（HSP）、尿素酶、细胞空泡毒素等及其亚单位成分均可以作为免疫原刺激机体产生保护性的免疫反应。幽门螺杆菌(H.pylori)疫苗用以预防和治疗,可大大减低与本菌感染相关的疾病,故其意义重大。动物模型H.pylori除人类以外仅能存在于猴及无菌仔猪胃中。因其无鼠类小动物模型,遂用能定栖于小鼠胃粘膜并引起胃炎的H.felis作为螺杆菌感染模型,又有用H.mustelae感染白鼬作为研制疫苗实验动物模型者。最近,Fox等发现H.pylori能自然感染猫并导致胃炎,遂采用新生猫崽作为H.pylori感染模型。霍乱毒素的佐剂效果Elson等曾报告,小鼠投予霍乱毒素(CT,为分子量约85kDa的蛋白质,含1个分子量约28kDa的A亚单位及6个分子量约10kDa的B亚单位,后者无毒性而与细胞膜结合性有关,10μg于小鼠可起佐剂作用)可使淋巴组织中的B细胞增强,而产生IgA抗体。Nedrud等则报道将仙台病毒同CT经口投予,可使小鼠特异性IgA抗体增加。如上所述,可以确认CT具有佐剂效果。Czinn与Nedrud等给BALB/c小鼠投以H.pylori超声波破碎物1mg(免疫原)和CT10μg(佐剂),或给白鼬分别投以免疫原7mg和CT60μg喂服,发现动物肠管粘液中的抗H.pyloriIgA抗体显著增升,血中抗H.pyloriIgA及IgG抗体亦呈上升,亦即证实CT确可使肠管粘膜的抗H.pyloriIgA抗体形成增强。于时,发现了经口疫苗有效的可能性,展开了H.pylori疫苗的研制。H.felis疫苗实验Czinn等(1993)将H.felis的超声波粉碎提取抗原与CT经口投予无菌小鼠,确证血中、胃粘膜和肠粘膜中IgA、IgG抗体明显上升后,过7～10天经口感染以H.felis活菌,结果免疫组仅4/17只受染,而对照组有14/18只受染,说明免疫组动物确实获得预防感染效果。
细菌热休克蛋白是在大多数微生物感染过程中产生的一组对细菌具有保护作用的膜相关蛋白，是1974年Tissieres等人在研究温度急剧升高后，果蝇各种细胞蛋白质合成所发生的变化时首先发现。后来还发现，不仅热刺激，而且其他因素，如化学毒物的刺激，也能诱导细胞合成此类蛋白质，并发生某些变化，是细胞应激反应的产物，故热休克蛋白也称为应激蛋白。幽门螺杆菌合成的热休克蛋白已鉴定的有Hsp10、Hsp10、Hsp10。在我国，李明峰等人已经克窿和表达 了幽门螺杆菌热休克蛋白Hsp10，了解了它们对蛋白质的折叠和分泌的作用。现在认为Hsp10在细菌的致病机制中起着重要的作用，如它可介导免疫调节、介导病原与宿主间的识别和黏附。Huesea等研究表明，当幽门螺杆菌在模拟胃内环境的低pH环境中时，Hp与其受体分子的结合特性会发生明显的变化，由于和Hp的Hsp70是受酸而不是耐热的，故它们提出了Hp与胃黏膜黏附的双受体模型，即胃内的低pH环境上调Hsp70的表达，表达的Hsp70呈现到细菌表面介导Hp与黏附层的硫苷脂结合：Hp穿过黏膜后再发生随后的胃上皮受体的结合。刘纯杰等克窿和表达了Hsp70基因，实现了该基因的融合分泌表达
Hp的致病机制到目前仍没有完全明了，但它应该包括适应胃内环境、黏附和致病等环节。据认为有多种黏附分子参与了Hp与胃黏膜上皮的黏附过程，热休克蛋白（heat shock protein，hsp）便是其中一种。1998年，huesca等报道，Hp的hsp70是一种可能的介导硫甘脂识别的黏附分子。为了进一步探讨Hp hsp70在细胞黏附中的作用及抗hsp70免疫在机体防止Hp在胃内定居的可能性，我们拟在真核细胞中表达此基因。
研究前景 DNA疫苗是继减毒、灭活的全病原体疫苗和基因工程表达的亚单位疫苗之后的免疫预防研究领域的第三次革命。1993年Ulmer等首次以流感病毒的血凝素(HA)抗原的DNA疫苗表达载体进行免疫接种并获得保护性免疫应答以后,关于DNA疫苗的研究进展迅速。病毒感染性疾病与肿瘤免疫的应答机制研究表明,之所以会出现病毒感染的慢性化或针对肿瘤细胞的免疫耐受,不仅是因为缺乏来源于病原体或肿瘤的有效抗原,而且还因为这些抗原的加工与提呈过程出现异常,因而不能十分有效地刺激机体产生保护性免疫应答。如一些慢性乙肝患者体内存在着相当数量的乙肝病毒表面抗原(HBsAg),却又不能诱导机体产生针对乙肝病毒有效的免疫应答,以清除体内的乙肝病毒。目前认为肝细胞虽然是分泌表达HBsAg的主要细胞类型,却不是一种很好的抗原加工与提呈细胞。近年来对于肌肉中的成肌细胞、皮肤的树突状细胞进行研究,发现这两种细胞是很好的抗原加工与提呈细胞。肌肉或皮下注射DNA疫苗以后,这些细胞不仅能够摄取、表达注射的质粒DNA,而且在蛋白质合成以后,蛋白质在细胞内的膜系统运输与分泌过程中,能够对于这些抗原成份进行加工,并与MHC抗原分子进行正确作用与结合,然后作为一种复合物形式表达在细胞表面,从而成为重要的抗原提呈细胞。这就是DNA疫苗研究的主要理论基础。
关于抗HSP70疫苗的研制，目前国内外也主要集中在口服疫苗的构建。然而由于多数非复制性的抗原经口服后其免疫原性非常弱，不能靶向运载至肠到的黏膜免疫系统，同时抗原容易被消化和降解，且胃肠的吸收率很低，无法刺激有效的免疫应答。DNA疫苗是将编码免疫原的基因插入细菌表达质粒，直接接种重组质粒，后者在体内表达并诱导免疫保护应答的抗原。其优点为：简便，无需体外表达、纯化抗原和应用佐剂。可在体内持续表达，从而可持续刺激机体产生免役应答，免疫效果好。能够克服其它疫苗很多缺点，具有很好的发展前途。我们拟构建hsp70DNA疫苗，并在真核细胞上表达hsp70，将表达hsp70的真核细胞免疫家兔，测家兔血清抗hsp70效价。
目前防治Hp的手段主要是抗生素的应用，但由于该菌产生耐药性，使得抗菌疗法日益受到限制，因此寻找有效的、安全的Hp疫苗显得十分重要。目前，关于hsp70的国内外研究主要集中在原核生物上的表达及其功能方面的研究。对于hsp70在真核生物上的表达，国内外鲜有报道，对于抗hsp70 DNA疫苗的研制，更鲜有报道。由于hsp70在原核生物的表达有其固有的缺陷性，表达产物是没有活性的包涵体。所以应用价值不大。本研究以真核细胞为表达载体，实现hsp70在真核生物上的表达，并直接用裸DNA肌肉注射免疫家兔，获得一定的免疫反应，为通过基因疫苗的方法防治Hp感染提供新的手段。
参考文献：
1. 刘纯杰。幽门螺旋菌热休克蛋白70基因的克隆和表达。生物化学和生物物理学报。2000，32（5）：524-528
2. Blaser M J.Hypotheses on the pathogenesis and history of Heliobacter pylori-induced inflammation. Gasterology,1992,102:720-727
3. Peterson W L. Heliobacter pylori and peptic ulcer disease. N Engl J Med,1991,324:1043-1048
4. Mchetti P,Kriess C, Kotloff K L ,Porta N, J L,Bachmann D M etal.Oralimmonization with urease and Escherichia coli heat -labile enterotoxin is safe immunogenic Heliobacter pylori-infected adults Castroenterology,1999,166(4):804-812
5. 林焕建。幽门螺旋菌表面抗原保护作用的体外与活体研究。中国微生态杂志。2003，01-0004-03
6. 王缚鲲。从包涵体中纯化重组人幽门螺旋菌热休克蛋白A亚单位。第三军医大学学报。2002，11-1332-04
7. 李明峰。幽门螺杆菌Hsp-CtxB口服疫苗的研制及免疫原性的研究。中国微生物和免疫学杂志。2002年7月22卷4期
8. First Department of Internal Medicine, Department of Microbiology, Nagoya City University Medical School, 1 Kawasumi, Mizuho-Cho, Mizuho-Ku, Nagoya, 467-8601, Japan.
9. First Department of Internal Medicine, Department of Microbiology, Nagoya City University Medical School, 1 Kawasumi, Mizuho-Cho, Mizuho-Ku, Nagoya, 467-8601, Japan.
10. Sauter B, Albert ML, Francisco L, Larsson M, Somersan S, Bhardwaj N. Consequences of cell death: exposure to necrotic tumour cells, but not primary tissue cells or apoptotic cells, induces
the maturation of immunostimulatory dendritic cells. J Exp Med
11.Gallucci S, Lolkema M, Matzinger P. Natural adjuvants. endogenous activators of dendritic cells. Nature Med 1999; 11:1249-55.
12. van Molle W, Wielockx B, Mahieu T, Takada M, Taniguchi T, Sekikawa K, Libert C. HSP70 protects against TNF-induced lethal inflammatory shock. Immunity 2002; 16:685-95.
13. Gurbuxani S, Bruey JM, Fromentin A et al. Selective depletion of inducible HSP70 enhances immunogenicity of rat colon cancer cells. Oncogene 2001; 20:7478-85.
14.Feng H, Zeng Y, Graner MW, Likhacheva A, Katsanis E. Exogenous stress proteins enhance the immunogenicity of apoptotic tumor cells and stimulate antitumor immunity. Blood 2003; 101:245-52.
15. Brar BK, Stephanou A, Wagstaff MJ, Coffin RS, Marber MS, Engelmann G, Latchman DS. Heat shock proteins delivered with a virus vector can protect cardiac cells against apoptosis as well as against thermal or hypoxic stress. J Mol Cell Cardiol 1999; 31:135-46.
16 .Binder RJ, Han DK, Srivastava PK. CD91: a receptor for heat shock protein gp96. Nature Immunol 2000; 1:151-5.
