张贵焘 译
复旦大学医学院
对于许多组织,人胚胎干细胞有着很好的潜能成为移植细胞最终选择的资源,为了使它们能够应用于临床,应有相应的细胞分化标准和安全的规范措施。细胞应是能够改善症状而无副作用,免疫排斥反应也应被克服。这些不同亚型分化细胞的免疫抗原是由其表达主要组织相容性复合体分子决定的。这里我们提出了一些克服人胚胎干细胞移植后遭受免疫排斥的方法。
最近从人胚泡(blastocyst-stage embryos)内层细胞群培养的多能性人胚胎干细胞(HESCs),为公众和科学界增添了把这些细胞用于移植治疗的期望,产生这种期望的原因有两个:(1)在细胞培养时,这些细胞好象有无限繁殖的能力同时保持未分化状态(2)能够被诱导分化形成三个胚芽层的细胞,这可通过体外转移这些细胞至非粘附板,可自发形成有分化结构的胚状体(embryoid bodies EBs);或向有重症联合免疫缺陷综合症(SCID)小鼠体内注入细胞,可演变为畸胎瘤(胚芽细胞瘤包含几种不同类型的组织)。然而这些方法会造成几种不同类型的细胞混在一起,而其中大部分是不能用于治疗使用。因此许多实验室首要目标是致力于控制它的分化和获得纯化的细胞类型。已有资料显示当添加生长因子时能够诱导HESCs分化和获得丰富的特定细胞群,像神经元,滋养层,内皮细胞,心肌细胞,造血祖细胞和肝细胞样细胞的形成。
在临床应用方面,HESCs衍生物相对于目前使用的成体移植细胞和胎儿源性细胞有其优点,这包括HESCs在培养条件下较易保持稳定性和可在更大程度上对HESCs进行遗传操纵等。对小鼠胚胎干细胞的遗传操纵和基因操纵极大影响着对其生物学性状和疾病的分析。HESCs遗传操纵方法的出现---像通过化学试剂转染,电穿孔和病毒载体---应该在细胞治疗和人胚胎分析方面发挥重要的角色。
然而,用HESCs的衍生物治疗前有几个重要问题是必须考虑的,移植的细胞必须是纯化的细胞,因为其它细胞会导致有害的反应和肿瘤。移植细胞可把有害物质从细胞系或培养细胞传递给病人,因此移植前必须筛出含有病原体的细胞和选用在培养中具有生长能力的细胞系。最后的担心是由于移植细胞表达非己蛋白质,移植HESCs衍生物可能会被病人的免疫系统破坏。
这篇综述集中探讨HESCs及其衍生物的免疫源性。诱发免疫反应的分子会在本篇中细胞间的机制阐述,并根据当前的知识对HESCs表达的分子进行讨论;此外我们描述的对于减少或完全阻断免疫反应对移植HESCs衍生物是有一定价值的。
HESCs表达的MHC蛋白质:
在大部分情况下,无遗传相关性的个体之间的组织或器官移植会产生免疫反应以及随之而来的免疫排斥。反应针对的是被宿主免疫系统认为非己物质的异种抗原。异种抗原的三种主要成分是主要组织相容性复合物(MHC),次要组织相容性复合物(mHC)和ABO血型抗原。MHC的不匹配是移植排斥的关键原因,相应地HESCs表达的这些分子会在本篇深入的探讨,而mHC和ABO抗原对组织排斥的影响相对较小,故在这里不集中讨论。
MHC蛋白被划分为两类,即MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ,相应地被人白细胞抗原基因HLA-Ⅰ和HLA-Ⅱ所编码。HLA基因有三种,分别为HLA-A,HLA-B,HLA-C。它们的产物同β2-微球蛋白形成复合物和构成细胞膜上MHC-Ⅰ分子的功能片段。大多数人有三对HLA-Ⅱ基因(HLA-DP,HLA-HQ,HLA-DR),可形成细胞膜上MHC-Ⅱ分子的功能片段,同抗原肽有关。HLA基因有两种机制阻碍人之间的器官移植:(1)在人染色体上HLA是最具多态性的基因,有数百个等位基因(2)至少有六个等位基因同时以共显性的方式表达,因此MHC等位基因的完全匹配在无遗传相关性的人之间概率是极低的,尤其因为单个HLA基因位点不匹配的情况导致的免疫反应的发生。这里我们首先讨论HESCs以及衍生物表达的MHC抗原,然后探讨这些分子在排斥反应中可能的机制。
最近检测到的HESCs表达的MHC蛋白证实了未分化的HESCs仅表达低水平的MHC-1,而向EBs内注入自发分化的细胞可增加2至4倍的表达,当细胞被诱导演变为畸胎瘤时可见到更高水平的表达(8至10倍);然而对其它体细胞的检测中MHC的绝对表达量仍然是很低的,如HeLa细胞。这些结果某种程度上不同于报道的MESCs的抗原的表达,即未分化的细胞是MHC-Ⅰ的负性表达和成熟EBs仅表达低水平的MHC-Ⅰ分子。
免疫反应中通常释放的细胞因子家族成员干扰素(IFNs)是MHC分子的诱导物,对培养的HESCs补充IFN-γ可相应提高MHC-1的表达,而IFN-α和IFN-β却没有任何作用。为进一步验证结果,DNA微量分析显示细胞内有IFN-γ的mRNA的表达,而无IFN-α和IFN-β的mRNA的表达。值得注意的是在HESCs演变成畸胎瘤后,所有的IFNs均有对MHC-Ⅰ分子的表达相似的刺激作用,在这个例子中其表达水平与检测的体细胞相似。同分化的HESCs类似,人胚胎癌细胞的衍生物也可被IFNs刺激诱导。相对于MHC-Ⅰ,即使加入IFNs,在分化和未分化的HESCs都缺乏MHC-Ⅱ分子的表达。然而当HESCs分化为造血细胞谱系时可能有MHC-Ⅱ的分子表达,因为这些分子是淋巴细胞的主要表达分子。
HESCs分化细胞的免疫识别:
伴随着移植的发生,HESCs的分化细胞表达的MHC导致异源性(alloreactive)T细胞对其产生排异反应,这是因为每个人约有1%--10%的T淋巴细胞能够把非己MHC分子作为外来抗原呈递给自身MHC复合物。然而排斥反应的起始通常不仅要有MHC分子的表达而且需要其它类型细胞的共刺激和辅助信号。例如,如果移植集落包含专门的抗原呈递细胞(APCs),他们可以迁移到局域淋巴结,在那里可以刺激产生异源性的记忆性T淋巴细胞使其转变为效应T细胞,然后效应T细胞通过循环直接返回攻击移植物。围绕这个问题,安全的策略应是消耗移植集落中的APCs,这会显著减少免疫反应的发生。CD4T细胞也可给记忆性CD8T提供辅助信号,因此作为移植使用的HESCs衍生物即使缺乏APCs,将仍然可能在CD4T细胞产生的辅助信号下被有排异反应的CD8T细胞排斥。
移植反应使HESCs分化细胞消失的其它可能机制是产生异种抗体和迟发性超敏反应(DTH),异种抗体是由于移植物的多态性抗原呈递给宿主APCs和然后再呈递T细胞的自身MHC复合物所激发产生的。这种方式就是当HESCs分化细胞的抗原结合T和B细胞表面受体,隐蔽抗体将会结合异种抗原,活化的补体系统对其破坏。相应地,在移植部位附近如果受体APCs摄入外来移植抗原,呈递给亚型辅助性T细胞,这些细胞释放一系列细胞因子,使巨噬细胞活化为浆细胞破坏组织。由于DTH,移植的HESCs衍生物遭受严重的破坏,因为这些细胞的抗原能够致敏Th1细胞。值得注意的是一种特殊的淋巴细胞亚型,即调节性T细胞(Treg)能负性调节异种抗原的免疫反应。看起来这些细胞在动物模型和人身上诱导对移植物的耐受是很有前景的,但不能肯定的是在HESCs衍生物中这些细胞能否使用。
在我们的研究中,用自然杀伤淋巴细胞(NK)检测了HESCs衍生物的耐受性,探讨这个问题是由于MHC-Ⅰ对NK细胞有抑制效应。HESCs低量表达的这些分子却有助于NK细胞的排斥反应;然而我们发现HESCs无关的分化细胞和体外MHC-Ⅰ的表达水平,NK不能杀死这些细胞。
为了确定NK细胞能否被HESCs表达的抑制信号所抑制,我们检测了细胞的非典型MHC-Ⅰ分子,即HLA-G,胎盘细胞滋养层的胎儿面几乎不表达HLA-G,避免了母亲的NK细胞伤害胎儿。胎盘细胞表达的典型MHC-Ⅰ分子是很低的,我们发现在HESCs分化的前或后以及添加IFN,HESCs都不表达MHC-Ⅰ,不同程度的阻抑(lysis)配体可激活NK细胞,提示活化信号的缺失,似乎可以相信HESCs不被NK杀死是因为缺乏识别信号,而不是抑制。
最小程度的HESCs衍生物排斥反应
对HESCs的分化细胞的免疫相关分子分析,提示细胞可作为外来抗原被不同反应T细胞识别,导致发生免疫排斥反应;然而,细胞可能不表达共刺激因子和MHC-Ⅱ蛋白,它们激活免疫反应的强度较低。不考虑对HESCs分化细胞产生免疫反应的程度,这里有几种可供选择的减少它们免疫源性的方法。
植入免疫特异部位:
同种异体移植后排斥反应发生的几率不仅要看MHC匹配的程度,而且要依赖于移植的部位。不同的动物植入眼的前部,脑和睾丸,它们的免疫反应都是被严格限制的,这些部位命名为免疫特异部位。其部位的形成至少有三种机制:(1)这些部位都有非典型的淋巴细胞消耗,以及与身体其它部位的接触被物理屏障隔开,如血脑屏障;(2)这些部位可产生免疫抑制因子,如β-转化生长因子(TGF-β)(3)表达Fas配体(FasL,CD95L),诱导含CDFas(CD95)的淋巴细胞凋亡。
这些部位能够限制MHC并不匹配的HESCs的免疫反应吗?收集的资料显示,帕金森病人植入MHC并不匹配的多巴胺能神经元后可延活数年并有效改善症状,甚至缺少免疫抑制,因此在免疫特异部位植入分化的HESCs对于改善症状是有效的。
细胞系匹配:
因为MHC异种抗原是被宿主T淋巴细胞破坏的主要目标,移植前许多精力是花费在寻找HLA表型相同的器官。理论上HESCs细胞系应该与病人的表型相同;然而只有构建一个非常大的HESCs免疫表型库才可满足大多数病人都相匹配的要求。等位基因由3个单独的MHC-Ⅰ基因片段组成,每个基因约有1000万个单模标本,可组成超过10亿个多态复合体。显然创建一个如此大规模的库是不可能的,但创建一个合适规模的库还是可行的,选择纯合子的HLA可减少规模,因为可忽略一些仅有很小排斥反应的等位基因,纯合子的HLA细胞系可通过单性繁殖获得。然而库的规模还可进一步减少,因为当细胞分化为非造血细胞时表达MHC-Ⅱ。
同基因HESCs细胞系的产生:
特定的同基因HESCs细胞系的传代培养可解决每一个病人的排斥问题,把HESCs体细胞核移植至摘除核的卵母细胞可得到,HESCs系可在胚泡阶段获得。这种方法除了线粒体DNA是由卵母细胞提供的外,可使细胞系的遗传性状与供体细胞核一致。最近,从猫和鼠身上的核移植胚胎成功的培养出胚胎干细胞,虽然相似的试验还未在人身上获得成功。
理论上,如果对体细胞进行程序重调,体细胞核植入HESCs也能够产生同基因的胚胎干细胞系。最近,MESCs同体细胞融合后证实重新构造杂核细胞通常能保留其多能性,但包含一条异常染色体;胚胎干细胞核的重新迁移或失活必须达到这样的标准,即新建细胞系的体细胞核应是遗传物质的贡献者。即使同基因细胞系可从体细胞核植入卵母细胞或从细胞融合获得,仍然不清楚由于线粒体多态性导致的mHC不同会不会激发免疫排斥反应。Lanza认为在牛身上mHC的不同不会导致移植排斥,类似的结果也可能在人身上看到。即便排斥反应被线粒体抗原所激发,其程度可能要比MHC不相匹配所导致的免疫排斥要小的多。
可供体细胞核移植的一种方法,HESCs细胞系可从人parthenotes获得,孤雌生殖是未受精的卵母细胞活化并且开始分裂的过程,最近从类人猿卵母细胞通过孤雌生殖培养出的多能干细胞增加了这种技术应用于人的希望。从免疫学的观点来看,这些细胞是非常有用的,因为它们完全同供体的卵母细胞相容,这意味着如果能从女性病人通过孤雌生殖获得多能干细胞,分化细胞的移植将不冒任何移植排斥的风险。而且这些细胞具有大多数的同源性,它们也可成为HLA库很好的供体,因为比起通常的异质结合胚胎干细胞系,它们拥有更大程度的匹配。由于HLA基因在六号染色体上有相关联的区域,孤雌生殖细胞系在治疗遗传性家族相关性疾病也有很大的优势。在减数分裂期间,如果HLA基因没有发生重组,虽然病人的mHC有百分之五十的不同,但仍有一半的HLA与其子孙相符合。总而言之,最终解决分化HESCs的排斥将是通过体细胞核移植或卵母细胞的孤雌生殖产生同基因细胞系。然而核移植技术的效率极低,尤其在灵长类;同时在伦理道德方面有着激烈的争论。相比之下,孤雌生殖的问题就少的多,因为它的胚胎在怀孕期间会正常停止而进行孤雌生殖的HESCs的分化细胞仍可对其调控。
嵌合性造血细胞的诱导耐受:
在某些情况下,如果宿主携带有数种特异造血细胞系,即嵌合造血细胞,MHC表型的相符并不是必要的。它的形成可通过把供体的骨髓细胞注入病人造成不同造血干细胞的共存。因此,居于胸腺的供体APCs有助于T细胞自我识别的负性选择,使移植器官时冒有限的风险。 这种方法对于HESCs分化物有着特殊的诊疗意义,这些细胞可产生两种造血细胞和其他类型的细胞,然而不同分化状态的细胞间却可形成耐受。此外,为防止移植物抗宿主免疫反应疾病(graft versus host disease GVHD)的发生,源于胚胎干细胞的造血祖细胞不能包含成熟T细胞。但通常这种方法需要用照射或细胞细胞毒性药物达到脊髓抑制的目的,所以嵌合造血细胞的主要的适用范围将是需要脊髓抑制治疗的病人。
Frandrich的最近一项研究,增加了从植入前胚胎培养的胚胎干细胞对供体特异耐受的可能性,如骨髓细胞。他发现在小鼠静脉注入MHC完全不匹配的未分化细胞,没有任何其他的人为条件下,鼠胚胎干细胞样细胞系(RESC)能形成稳定的嵌和细胞系。惊奇的是细胞分化为单核细胞和B细胞后可以接受具有同样血统小鼠的心脏移植,而不是不同血统。作者认为细胞注入体内后并不立即发生排斥是因为它们不表达MHC-Ⅱ和共刺激因子,宿主T淋巴细胞并没有被激活。由于它们表达FasL,移植细胞可被宿主淋巴细胞保护。 HESCs能否以同样的方式获得免疫耐受呢?由于可能形成畸胎瘤,注入未分化的HESCs存在高度危险,而RESC还没有发现这种情况。我们也没有迹象表明HESCs能像RESC那样在体内将会分化和执行胸腺APCs细胞的功能,即对宿主产生特异免疫耐受。因此,关于HESCs这方面的潜能还不清楚。
制造一种通用的细胞:
构建一种能够移植入每一个人的通用细胞系是再生医学的首要目标。一种方法是减少MHC分子的表达,例如敲除MHC-Ⅰ分子呈递所必需的β2-微球蛋白基因。HESCs不表达MHC-Ⅱ,除非HESCs朝向造血细胞分化了,否则这样的细胞系是没有MHC分子的表达,因此可以减少异源性T细胞的免疫源性。然而值得注意的是把敲除MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ基因的小鼠的移植组织植入同种异体的宿主仍然可能发生排斥,其机制可能是通过T淋巴细胞依赖机制。明显在这些情况下,残余MHC的表达足够诱发异源性T细胞的增殖,而且低水平的MHC表达也能诱导NK细胞杀伤。因为分化的HESCs不表达阻抑NK的配体,敲除β2-微球蛋白基因的细胞不能致敏NK介导的杀伤。然而,T细胞对于分化HESCs的反应仍然不清楚。
相应地,通过利用免疫特异部位的自然选择机制也能构造通用的HESCs细胞,免疫特异部位的一种标志FasL,它的表达可以诱导表达Fas的T细胞凋亡。最近采用异位FasL的表达保护移植物的方法产生了有争议的结果。如在移植部位附近有Fas的表达,移植的心脏或胰腺表达FasL会加速其排斥;而在肝,肾,肺,血管和胸FasL的表达会降低同种异体移植的免疫反应,因此FasL的表达保护HESCs遭到排斥,一个主要的并发症是移植细胞表达Fas,会使有FasL的细胞遭受破坏。
结论:
相对于只有很少的可利用的移植器官,HESCs被认为有望成为再生医学最终选择的细胞资源。为了了解其潜能,检测这些细胞与病人不向匹配时发生的免疫反应是十分必要的。激活排斥反应最主要的是MHC分子,HESCs是低水平表达MHC-Ⅰ分子,在分化和用IFN诱导时表达水平上调。由于免疫系统对非己的识别造成对HESCs衍生物的排斥,使这些细胞对于临床的应用构成障碍。为了解决排斥反应,可植入限制免疫排斥的免疫特异部位或构建HLA表型的HESCs细胞系库。通过体细胞核移植或孤雌生殖产生同基因细胞系也是好办法,但在广泛应用前许多技术或伦理问题必须解决。其它的方法还包括对造血祖细胞诱导其免疫耐受和用遗传操纵的方法构建一种通用的细胞系。