由中国科学院主办、中国科学院武汉病毒所与湖北省暨武汉微生物学会承办的“2004年中国科学院新生病毒性疾病控制学术讨论会”日前在湖北省武汉市召开。来自我国、美国、英国、澳大利亚、新加坡等国家的专家和学者22人介绍了SARS、AIDS、肝炎病毒、流感病毒、疱疹病毒等医学病毒学科发展前沿相关领域内重要科技成果,对病毒性疾病药物筛选、疫苗研制等高新技术研发中的热点及难点问题进行探讨,交流国内外在烈性和新生病毒学领域最新研究动态,探索预防和控制病毒性疾病的传播和流行的有效方式。国内外相关研究领域的230位代表参加了此次会议。
阻止HIV的黏膜感染
揭示HIV-1的侵入、传播和抑制机制
艾滋病仍然在全世界蔓延,我国正以前所未有的严峻形势面临着艾滋病的挑战。留学英国的胡勤学博士在这次会上介绍了他在艾滋病研究中的新成果。胡勤学说,黏膜感染是最主要的HIV-1传播方式,HIV-1通过异性间的性途径传播就是最常见的黏膜感染。
胡勤学认为,对HIV-1黏膜感染中主要的感染细胞群以及特异的细胞受体的确定,将非常有利于了解HIV-1感染的病理机制以及发展有效的预防与控制措施。他们用一种阻止HIV-1进入的抑制剂作为研究宫颈组织HIV-1感染中的首选辅助受体,并试图了解HIV-1黏膜感染传播中迁移细胞以及结合受体的作用。通过阻断CD4受体或者同时阻断CCR5和CXCR4辅助受体,可以抑制局部的HIV-1的黏膜感染。相对而言,同时阻断CD4受体和甘露糖C类凝集素受体(MCLR)———包括但不局限于DC-SIGN,对于抑制迁移细胞的HIV-1摄入和病毒的传播是必要的。另一方面,直接针对HIV-1的结合物———单克隆抗体b12以及可溶性CD4的融合蛋白CD4-IgG2,可以有效阻止HIV-1的局部感染和传播。
据胡勤学介绍,利用流式细胞仪对迁移细胞的检测发现,迁移细胞主要分为CD3+HLA-DR和CD3-HLA-DR+两类,而后一类细胞中的很大成分是表达DC-SIGN受体的,磁珠分选研究显示这类CD3-HLA-DR+细胞承载了90%的HIV-1传播。另外一项针对未成熟单核细胞来源的树突状细胞的研究显示,当MCLR和CD4作为HIV-1的gp120蛋白主要受体时,病毒的捕捉和摄入将采用一种不同的机制。他说,他们的研究确认了HIV-1黏膜(宫颈组织)感染中起主要作用的细胞受体,从而为抗病毒药物的设计凸显了一个非常好的靶点。
据了解,胡勤学博士是中科院武汉病毒所培养的研究生,毕业后留所工作,现在英国留学。近期,NatureReviewImmunology(2004年6月)的HIGHLIGHTS栏目,高度评价了胡勤学博士在艾滋病研究中的工作进展.这篇题为“Pullingoutthestops”的综述性评价指出,在没有有效疫苗的情况下,阻碍HIV-1黏膜细胞表面的侵染和传播可能是人类能够阻止HIV传播的最好的办法。近期的TheJournalofExperimentalMedicine报道了胡勤学等人利用能够和HIV-1结合的细胞表面受体为靶标的特异抗体和化合物抑制HIV在人的宫颈组织的侵染和传播的研究。在较为详细地介绍了胡勤学等人的研究工作后,文章最后指出,必须对病毒的吸附和感染有非常详细的了解,这样我们才能设计新型的杀菌剂,提供足够的保护,阻止HIV通过性传播。这篇报道证明了HIV在侵染人宫颈组织中所利用的主要受体,有助于高特异性杀菌剂的发展。
预防新生病毒病疫苗研究获突破
近年来,新生病毒病层出不穷。如1994年发生在澳大利亚的Hendra病毒病,1997年发生于澳大利亚新南威尔斯地区Menangle病毒病,1998年至1999年在马来西亚暴发的Nipah病毒病,2003年暴发的SARS,以及2004年在东南亚暴发的高致病性禽流感病毒。新生病毒病严重危害人类的生命安全,研究安全有效的疫苗是控制新生病毒病的有效手段。
中国微生物学会医学微生物与免疫学专业委员会副主任委员、中科院武汉病毒研究所流感病毒学科组组长陈则研究员,主要从事流感病毒和SARS-CoV疫苗的研究。在这次会议上,他着重介绍了近年来在新生疾病及其疫苗研究的新进展。陈则研究员介绍说,近年他们对新生病毒病研究主要集中于SARS病毒疫苗、禽流感病毒流行病学调查及其疫苗、人流感病毒疫苗研究。
他说,在SARS病毒疫苗研究方面已取得比较大的突破。他们大量增殖SARS-CoV病毒,并对其进行灭活、纯化,制备灭活疫苗。用灭活疫苗(加入或不加入佐剂),以不同的剂量免疫小鼠,能够诱导小鼠产生抗体,加入佐剂组所产生的抗体高于不加入佐剂组。他们的研究还表明灭活疫苗诱导产生的抗体在体外能很好的中和SARS病毒,为最终研制有效的疫苗跨出了扎实的一步。
在禽流感病毒流行病学调查及其疫苗研究方面。2004年初,我国受邻近国家禽流感暴发的冲击和影响,养禽业受到了重创。据陈则介绍,2004年3月,他们对广东和广西等地的调查。采集宿主范围:家鸭、猪、小鼠、野鸭、野生鸟类;采集样品种类:粪便、鼻咽拭子、泄殖腔拭子、血清。完成了9株病毒的全基因组测序,对禽流感病毒进行了深入的遗传进化分析。目前使用的禽流感疫苗不能很好地控制高致病性禽流感H5N1病毒的流行和传播。他们的疫苗研究试图探索出一种高效的疫苗免疫途径,使疫苗能够完全保护禽类免受高致病性禽流感的感染。实验发现全病毒灭活疫苗初免,DNA疫苗加强能为小鸡抗禽流感提供100%的保护。是一种有效的免疫程式。
在人流感病毒疫苗研究方面。陈则说,他们以往的实验表明,表达流感病毒HA、NA基因的DNA疫苗是有效的抗流感病毒疫苗成分。为了解决DNA交叉免疫保护能力有限的缺陷,他们构建了截短的HA、NADNA疫苗,可以用于将来构建多价DNA疫苗。实验结果表明:A型流感病毒HA基因缺失核苷酸的部位不同,缺失片段的质粒对于保护小鼠抗致死量流感病毒攻击的能力不同;随着NADNA连续缺失的核苷酸数目增多,NA-DNA诱导的抗体效价下降,甚至失去保护作用。
戊肝疫苗研究曙光初露
厦门大学福建省医学分子病毒学研究中心夏宁邵教授在会上表示,由他们承担的HEV中和表位的发现、结构基础及重组疫苗研究已经取得阶段性成果,戊肝疫苗目前已经完成临床前研究,将进入I期临床试验阶段。
戊型肝炎病毒(HEV)是急性肝炎的主要病原体之一,并常引起暴发流行。1986~1988年间我国新疆南部的HEV大流行造成了12万人发病,千余人死亡。夏宁邵教授介绍,HEV为无包膜二十面体对称结构RNA病毒,其病毒衣壳由ORF2编码的单一蛋白组成。在大肠杆菌中表达的ORF2的一个片段(E2)可以自发形成以二聚体为基础的多种聚合结构,二聚体蛋白与病人血清的反应性显著强于单体蛋白,提示二聚体蛋白形成了HEV的重要免疫优势表位。E2蛋白免疫恒河猴可以对HEV产生完全的保护性。用E2抗原制备了8株单克隆抗体,其中6株对二聚体的反应性强于单体,提示识别构象型表位;两株对二聚体、单体及变性蛋白的反应性相当,提示识别线性表位。以单抗进行HEV的免疫捕获PCR,仅8C11、13D8和8H3单抗能够直接捕获病毒,提示识别病毒颗粒表面的暴露结构。这三株单抗的交叉阻断实验发现,8C11和13D8可以相互完全阻断,提示识别同一表位区域,而13D8对8H3不能阻断,8C11非但不能阻断8H3,而且对8H3的结合有显著增强作用。利用Biacore生物传感器测定这3株单抗及其Fab的亲和常数(KD),8C11和13D8的KD值均为20纳米左右,其Fab片段的KD值较完整抗体有数十倍的提高,可解释为完整抗体的二价效应;8H3单抗的KD值
为1000纳米左右,但其Fab的KD值也大幅度下降,提示Fab可以更容易地接近抗原表位并与之结合,意味着E2抗原上的8H3表位被其他结构所部分遮盖,而8C11与抗原的结合可能引起了抗原空间结构的改变,从而去除了对8H3表位的遮盖,导致8H3表位与抗原结合的显著增强。病毒捕获PCR证实了8C11对8H3表位结合的增强作用,这一现象同样存在于天然HEV,而不仅仅是在重组抗原E2上。用8C11、8H3分别以及联合孵育HEV,再感染恒河猴,结果8C11和8H3均可中和HEV的感染性和致病性,而且二者有明显的协同中和作用,证实8C11和8H3均识别病毒中和表位。
夏宁邵教授介绍,对E2抗原的系列缺失突变、点突变和延伸突变研究发现,E2的C末端的6个氨基酸的强疏水区域对于二聚体及中和表位的形成至关重要,破坏该区域的疏水性会引起二聚体无法形成以及中和表位活性的丧失。
他们对E2的延伸突变体的研究发现了另一个重组蛋白239,可以组装成平均直径15纳米的类病毒颗粒(VLP),并保持良好的中和表位活性。用239蛋白制备的疫苗的免疫原性较E2疫苗有显著的提高,动物实验证实239疫苗能同时对同型和异型病毒感染提供完全保护。目前该疫苗已完成临床前研究,即将进入I期临床试验。
寻找病毒致病致癌的“钥匙”
———病毒与细胞因子的相互作用及其功能研究
病毒与细胞因子的相互作用及其功能研究是揭示病毒致病和致癌分子机理的基础,能为病毒性疾病的防治提供理论依据。病毒学教育部重点实验室、武汉大学生命科学学院吴建国教授和新加坡国立大学肿瘤研究所黄灿华博士分别介绍了目前此方面的研究进展。
HBx蛋白吴建国教授介绍,他们通过酵母双杂交系统筛选以及正常组织与肝癌组织cD鄄NA文库差异筛选等方法和手段,分离、鉴定出多种与HBx蛋白相互作用的新的细胞因子,并对新发现的两种细胞因子(Hepsin和未知蛋白)进行了系统的研究。结果发现,Hepsin和未知蛋白分别与HBx蛋白结合后,对病毒复制、细胞凋亡、细胞增殖等方面均有不同程度的影响,为进一步研究乙肝病毒致病和致癌的分子机理提供新的信息。
COX-2基因环加氧酶-2(COX-2)基因是一个可诱导的基因,在人体正常组织及细胞中处沉默状态,但在病毒感染,细菌入侵或缺氧的条件下,该基因被激活而表达,而且COX-2的表达与机体炎症反应密切相关并可能与致癌有关。他们从转录水平上研究病毒(SARS、乙肝、流感病毒等)蛋白诱导COX-2表达的分子机制以及鉴定参与COX-2转录调控的细胞因子。实验证明,SARS病毒S和N蛋白、乙肝病毒X蛋白、流感病毒HS1蛋白等能通过不同的细胞转录调控因子来调节COX-2的表达及其与功能。
此外,吴建国教授还介绍,他们综合采用设计与化学合成新的抗病毒药物、筛选抑制病毒基因表达的小分子干扰RNA、研发抗病毒疫苗等方法与手段:筛选出一种影响乙肝病毒基因表达的小分子化学药物;设计与筛选出分别和同时抑制乙肝病毒与艾滋病毒(HIV)复制的小分子干扰RNA;开展了以减毒伤寒杆菌为载体的艾滋病毒疫苗与肝炎病毒疫苗的研究,为探索病毒病防治新途经打下了基础。