结核病是世界上主要传染病的死因，特别是多重耐药性结核病的暴发流行和严重危害性，引起人们的重视。各国学者对结核杆菌的耐药特征，耐药的分子机理及涉及基因等方面的问题进行广泛研究，并且取得许多重大进展。本文就这方面进展作一综述。
目前，一个突出问题是多重耐药结核病(multiple-durg resistance tuberculosis，mdrtb)是指结核菌对2种或2种以上的抗结核药产生耐药性。1990年以来美国疾病控制中心报道12起mdrtb的暴发流行。200例4～16周内死亡，死亡率高达72％～89％。aids病人和hiv携带者更易感染mdrtb，这引起人们对mdrtb的高度重视。随着hiv感染的蔓延，mdrtb已成了全球共同面临的挑战。近年来，各国学者采用分子生物学技术对结核杆菌耐药机理进行深入研究，定位了结核杆菌耐药基因的位置和基因突变位点，从而促进了第一代快速鉴定耐药突变菌株方法的建立和新型抗结核药物的开发。本文就这方面进展作一简介。
■一、结核杆菌的耐药特征
细菌获得耐药性的方式大致有三种类型，即障碍机制(降低细胞膜的通透性和外排泵机制)，产生降解或灭活酶类(如：β-内酰胺酶)，药物靶位的改变(如：某个关键基因的突变)。细菌可通过外源性遗传因子如质粒或转座子或者染色体自身而获得耐药特性。结核杆菌与多数细菌相似，也是通过上述方式获得耐性。结核杆菌特有细胞壁降低多数药物通透性，结核杆菌产生诸如β-内酰胺酶的降解酶类和其它药特修饰酶。因此，结核杆菌对常见抗生素天然耐药。但是，与其它人类致病菌最显著差别在于结核杆菌不存在质粒，即无法通过质粒的介导从其它细菌或分枝杆苗获得耐药性[1,2]。因此，染色体介导的耐药性是结核杆菌产生耐药的主要形式，mdrtb的研究揭示染色体多个相互独立基因自发突变的逐步累加是mdrtb耐药的分子基础。
■二、结核杆菌的分子耐药机理
1. 异烟肼(isoniazid，inh)
异烟肼通过抑制结核杆菌分枝菌酸的合成，造成细胞壁破损而杀菌。inh的耐药性与一个或多个基因的多种突变有关。这些基因包括编码触酶-过氧化物酶的katg基因，编码enoyl-acp还原酶的inha基因和编码烷基-氢过氧化物还原酶的ahpc基因。katg基因和inha基因涉及分枝菌酸的生物合成。ahpc基因涉及细菌对氧化压力的反应。结核杆菌摄取inh后，菌体内触酶-过氧化物酶氧化inh，形成活性中间产物，后者可抑制分枝分菌酸合成酶enoyl-acp还原酶，使分枝菌酸合成减少。zhang等将katg基因克隆导入耐inh的耻垢分枝杆菌，可恢复药物敏感性[3]。临床分离的约50％inh耐药株，katg基因存在点突变或缺失，使触酶-过氧化物酶的活性丧失，导致无活性的inh中间产物产生。约25％inh耐药株与inha基因的突变相关，多数突变造成inha基因表达增强，从而增强相应酶的数量，超过了药物抑制作用。最近发现约10％inh耐药株中，katg、inha基因完好，ahpc基因有突变，推测ahpc 基因编码的酶与inh中间产物的解毒有关[4]。一般将ahpc突变作为katg基因损伤的标志。尽管如此，依然有10％inh耐药株的分子机理不清楚。
2. 利福平(rifampin，rfp)
利福平为一种广谱抗菌药物，它可与dna依赖的rna聚合酶的β亚单位结合，从而抑制mrna的转录。几乎所有的rfp耐药的细菌，都是由于编码rna聚合酶β亚单位的rpob基因某个特定区域的突变，使之不再与rfp结合而耐药。结核杆菌也不例外，临床分离的97％以上的结核杆菌、麻风杆菌和乌分枝菌rfp耐药株，它们rpob基因均有突变。在rfp耐药结核杆菌rpob基因中央附近69bp的高变区域内，存在35种以上不同的错义突变，其中丝氨酸531→亮氨酸(ser531→leu)和组氨酸526→酷氨酸(his526→tyr)的两种突变最常见，约占总突变65％以上[5]。13％rpob基因突变的rfp高度耐药株仍对利福布丁(rifabutin)敏感，提示可采用利福布丁治疗某些rfp耐药的结核病。
3. 链霉素(srreptomycin，sm)
链霉素是抗结核治疗中常用氨基糖甙类抗生素。sm与结核病16s rrna结合，干扰翻译的准确性，从而抑制蛋白质的合成。sm耐药性与编码核糖体的二部分基因突变有关，它们是编码16s rrna的rrs基因和编码s12蛋白的rpsl基因。rpsl基因编码蛋白质的氨基酸取代影响了16s rrna的高级结构而携带sm的耐药性。16s rrna结构的改变破坏了16s rrna与sm的相互作用，导致sm耐药[6]。rpsl基因是主要突变位点，其中密码子43最常见，密码子88较罕见。。16s rrna分子的环状结构为次要突变点，即491，513，516，903核苷酸位点上[7]。临床分离sm耐药株中，rpsl基因与rrs基因的突变频率分别为50％和20％。约1/3sm耐药菌株的耐药机理尚不清楚。
4. 乙胺丁醇(ethambutol，emb)
乙胺丁醇的抗菌活性仅局限于分枝杆菌，提示药物靶位是一 种分枝杆菌特有的结构，进一步研究证实乙胺丁醇可选择性地抑制分枝杆菌细胞壁的重要结构成分——阿拉伯半乳聚糖和脂阿拉伯甘露聚糖的生物合成。最近鉴定了emb区域的一簇基因，emb区域基因的表达增强造成了乙胺丁醇的耐药性。初步研究显示emb基因编码多种合成细胞壁阿拉伯聚糖必须的酶类，其中embab基因编码阿拉伯糖基转移酶，embab基因的突变或过度表达可导致持续合成阿拉伯聚糖而耐药。50％emb耐药株的embab基因发生突变[8]。突变位点和乙胺丁醇与emb蛋白作用特点正在研究中。
5. 吡嗪酰胺(pyrazinamide，pza)
pza作用机制和耐药分子机理尚不清楚。一般认为pza是通过在菌体内被吡嗪酰胺酶转化为吡嗪酸而发挥作用。分析结核杆菌和牛分枝杆菌pza耐药株，发现该酶活性显著降低，提示酶活性丧失与耐药密切相关。scorpio等发现编码吡嗪酰胺酶的pcna基因是造成结核杆菌pza耐药的原因。对pza耐药菌株的pcna基因突变，吡嗪酰胺酶活性丧失，使pza转化为吡嗪酸减少而导致pza失效[9]。
6. 氟喹诺酮类(fluoroquinolones，fq)
mdrtb的暴发流行使fq成为最主要的二线抗结核药物。fq在抗结核治疗中的广泛使用，导致fq耐药菌株数量急剧增加。fq耐药机理极其复杂，与耐药发生有关因素包括(1)dna旋转酶，(2)拓扑异构酶ⅳ，(3)细胞膜蛋白，它通过介导药物的通透性和外流来调节胞内的药物浓度。多个基因突变逐步累加是获得高度耐药性的基础。fq作用靶位是dna旋转酶，由gyra和gyrb基因编码的2个a亚单位和2个b亚单位组成。结核杆菌对fq的耐药与gyra和gyrb基因突变有关。gyra基因多步突变的发生可推测结构杆菌对环丙沙呈和其它fq高度耐药。gyrb基因的突变可能改变胞内药物的蓄积而呈现低度耐药[10]。75％～94％fq耐药结核菌的gyra基因有突变。最近发现的编码结核杆菌细胞膜外排泵蛋白的lfra基因，它编码的蛋白可传递低度耐药性[11]。
■三、结核杆菌耐药基因的检测方法
研究结核杆菌耐药分子机理的重要目的之一是建立一套快速鉴定结核杆菌耐药基因类型的方法，了解结核病患者的耐药状况，指导临床的化疗和防止耐药菌体的播散。理论上，耐药基因的分析不需培养结核杆菌，因此与传统结核杆菌药敏试验相比有诸多优点，包括检测时间从数周和数月缩短为几天；实现了自动化；降低实验室生物危险性。耐药检测包括pcr扩增基因组内携带耐药性区域，然后扩增产物的突变分析，应用于结核杆菌耐药基因突变分析的技术较为成熟有直接测序法，单链构象多态性分析(sscp)及固相杂交法。
1. 直接测序法
耐药区域pcr扩增，prc扩增产物纯化或克隆化取dna片段直接测序，与标准敏感菌株的同一dna片段比较，分析碱基突变的位置和分布。直接测序法是鉴定突变的黄金标准，但该操作繁琐，费用昂贵限制了它的广泛应用。kapur等应用自动化dna测序法分析128株临床分离的结核杆菌rpob基因69bp区域的突变特征，证实90％以上rfp耐药株rpob基因有碱基改变，而且多数为错义突变[12]。altamirano等对9株异烟肼耐药株及1株敏感株进行研究，通过dna直接测序证实有8例(89％)存在突变，突变包括点突变，1bp的缺失和3bp以内的插入。指出katg基因突变在inh耐药中占着比较重要地位[13]。
2. 聚合酶链反应-单链构象多态性分析(prc-sscp)
pcr-sscp是检测单碱基置换和数碱基缺失或插入的可靠而简便方法，比直接dna测序容易进行，而广泛用作一种突变筛选方法。原理是单链核酸通过自身互补或分子内的相互作用形成折迭构象，单个核苷酸的突变可造成其构象改变，从而导致其在非变性凝胶电泳上迁移速度的改变。telenti等采用pcr-sscp分析122株结核杆菌rpob基因中央区域157bp片段，66株耐药菌株中64株有突变。56株敏感株没有突变。结果显示pcr-sscp能检出单个碱基突变，可作为检测rfp耐药株的快速筛选方法。作者用荧光素标记pcr扩增产物而建立自动化sscp分析法，可直接检测痰涂片阳性标本和bactec阳性培养物中的rfp耐药菌株[14]。采用该技术，每天可检测40份标本，因此适用于大量标本的快速筛选。作者采用自动化pcr-sscp技术对来自mdrtb暴发流行中分离的结核杆菌耐药性进行分析，pcr-sscp检测inh耐药性的灵敏度为87％，katg，inha，katg-inha，abpc和katg-abpc的突变率分别为36.8％，31.6％，2.6％，13.2％和2.6％[15]。说明自动化pcr-sscp是大量标本或多个靶基因分析的最佳方法。
3. 固相杂交法
探针杂交法是检测耐药基因突变的另一种快速简便筛选方法。de beenhouwer等根据结核杆菌rfp耐药ropb基因突变资料，设计一组覆盖69bp ropb高变区的寡核苷酸探针，包括结核杆菌探针一个，覆盖69bp ropb高度区的野生型探针5个，ropb突变特异的探针4个。依次固定于尼龙膜上，然后与待测菌株ropb基因扩增片段进行杂獢A根据杂交谱带判断有无突变及突变的类型。因采用多个探针且固定于尼龙膜上形成多列，作者称此方法为多列探针检测法(line probe assay，lipa)[16]。该方法可快速鉴定结核杆菌rfp耐药株ropb基因的突变，适合于临床标本的直接检测。现已有商品化lipa试剂盒，该试剂盒检测配药物敏感试验结果的符合率为90.2％[17]。
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