微生物学报Acta Microbiologica Sinica
48(3)：375~379; 4 March 2008
基金项目: 国家“863 计划”(2006AA10Z434); 农业部重点攻关项目(2006-37)
*通讯作者。Tel: +86-23-65120489; E-mail: zkwang646@sina.com
作者简介: 黄冠军(1982. ), 男, 广西桂林人, 硕士研究生, 研究方向为分子微生物。E-mail: huangguanjun574@163.com
收稿日期: 2007-07-13; 修回日期: 2007-11-07
ISSN 0001-6209; CN11-1995/Q
黄冠军1, 殷幼平1, 张仑1, 李小焦1, 葛建军2, 陈洪俊2, 王中康1*
(1 重庆市功能基因与调控技术重点实验室, 重庆大学生物工程学院, 重庆 400030)
(2 中国检验检疫科学院动植物检疫研究所, 北京 100029)
摘要：根据柑桔溃疡病菌(Xanthomonas axonopodis pv. citri, Xac)独有的蛋白基因序列和锁式探针公共连接序列分别设计特异性的锁式探针及其扩增引物, 优化系列反应条件, 建立了特异性的柑桔溃疡病菌滚环扩增体系。初步检测结果表明该体系能够特异性地检出Xac 的菌体细胞及其DNA, 而检测不出供试的其它植物病原细菌和柑桔叶面常见的多种附生细菌; 对Xac 靶片段克隆质粒DNA的检测灵敏度为102 copy/μL, 对Xac 菌悬液的检测灵敏度为20 cfu/μL, 比常规PCR 的检测灵敏度稍高。用滚环扩增技术和常规PCR 技术对田间采集的实际样品进行了检测, 两种方法的检测结果没有显著差异(P>0.01)。由于锁式探针的公共连接序列对扩增的条件要求一致, 本体系的建立可以为植物病原微生物多靶标检测和病害检疫检验提供新的技术支撑。
关键词：柑桔溃疡病菌; 锁式探针; 滚环扩增; 多靶标检测
中图分类号：Q78 文献标识码：A 文章编号：0001-6209 (2008) 03-0375-05
柑桔溃疡病(Citrus bacterial canker disease,CBCD)是影响全球柑桔种植业发展的重大检疫性病害, 能够侵染为害绝大多数柑桔栽培品种, 其病原菌为地毯草黄单胞柑桔致病变种(Xanthomonas axonopodis pv. citri, Xac), 是国内外重大检疫性病害。因抗病特效药剂缺乏, 澳大利亚、巴西、中国等柑桔产区对柑桔溃疡病显症苗木依然只能沿用挖除病树集中烧毁的根除方法。目前我国正在实施柑桔非疫生产区建设以及疫区定界调查、果园疫情动态监控, 都迫切需要建立快速、特异、准确的诊断技术。基于靶标DNA 扩增的PCR 技术作为成熟的分子检测方法, 已用于该病原菌的检测鉴定[1.3], 而基于锁式探针(Padlock probe)的滚环扩增检测技术(Rolling circle amplification, RCA)是近几年发展起来的新的分子检测方法, 锁式探针独特的设计不仅具备PCR 的高特异性、高灵敏度的优点, 还能现实多靶标的平行检测,已越来越多的用于分子生物学基础理论研究和核酸实际检测[4.7]。锁式探针(Padlock probe)及其应用是Nillssion等[8]首次报道的, 其原理是只有当锁式探针和相应的检测靶DNA 同时存在于连接体系中且完全互补配对时, 线型锁式探针才能在连接酶的作用下被有效地连接成环型, 而在没有相应靶DNA 存在时锁式探针不被连接酶连接, 仅以线性形式存在。在核酸外切酶的作用下, 线性形式存在的锁式探针被消化水解, 而连接成环状的锁式探针就可以在接下来的扩增反应中得到扩增[7]。对扩增产物或扩增信号进行分析, 就可以判断连接体系中是否存在检测靶DNA。本研究旨在依据柑桔溃疡病菌独有的蛋白基因序列, 设计特异的锁式探针及其扩增引物, 优化RCA 条件, 建立特异、准确的柑桔溃疡病菌滚环扩增检测技术体系,为我国的柑桔非疫区建设和维护, 柑桔溃疡病的疫情动态监测与控制提供又一新的分子检测技术。
全文下载：柑桔溃疡病菌滚环扩增检测体系的建立
更多全文请查看链接：http://journals.im.ac.cn
声明：本文由《微生物学报》授权生物谷 www.bioon.com 网站发布，如需转载请直接与中国科学院微生物研究所期刊联合编辑部联系并支付相应费用，未经授权不得转载，若转载将付相应的法律责任。
