微生物学报Acta Microbiologica Sinica
48(3)：385~390; 4 March 2008
卢建红**, 唐运莲**, 周鸣, 武明花, 欧阳珏, 高建明, 张荔茗, 李丹, 陈琼, 熊炜, 李小玲, 唐珂, 李桂源*
(中南大学湘雅医学院肿瘤研究所, 长沙 410078)
摘要：为了在Epstein-Barr 病毒(EBV)172kb 的基因组中引入突变以研究基因功能, 建立了一种简单有效的基因操作方法。在载体pcDNA3.1(+)上操作, 将两端含有重组蛋白FLP 识别位点(FRT)的卡那霉素筛选标记基因(kan)与鼻咽癌(NPC)来源的、包含LMP1 基因全长ORF 的gDNA“无缝”连接(无外源序列插入)。连接后的kan-LMP1 线性DNA 片段经转化、由λ噬菌体中redαβγ 系统介导在E.coli中发生同源重组(ET 克隆), 用kan-LMP1 替代了BAC-EBV(p2089)中相应的LMP1 基因区域, 然后经过重组蛋白FLP 对FRT-kan-FRT 特异性的识别, 切除了引入的kan 基因, 留下一个69bp 的FRT“疤痕”。通过抗性筛选和对菌液进行PCR 扩增可以鉴定突变子。这种经改进并程序化的方法, 也适应于引入其它突变或在其它BAC-疱疹病毒基因组中引入突变。
关键词：EB 病毒; 突变; 同源重组; 线性转化
中图分类号：R739.63 文献标识码：A 文章编号：0001-6209 (2008) 03-0385-06
疱疹病毒科的成员是感染人和动物的重要病原,对它们的研究具有重要意义。EB 病毒(Epstein-Barrvirus, EBV)属于γ 疱疹病毒亚科, 基因组大小约172kb,包含近100 个基因, 编码200 多种蛋白, 但大多数基因的功能还不清楚。EBV 与多种人类恶性肿瘤如Burkitt 氏淋巴瘤和在中国南方高发的鼻咽癌(Nasopharyngeal Carcinoma, NPC)相关[1]。为研究病毒基因功能, 对特定基因进行修饰构建病毒突变子具有重要价值, 但是由于疱疹病毒基因组大, 产生重组病毒一直是个难题。近年来把细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome, BAC)技术应用于疱疹病毒的感染性克隆为疱疹病毒基因组学提供了重要的技术平台[2,3]。BAC 中的F 因子使之能在大肠杆菌(Escherichia coli, E.coli)中的复制受到严格控制并保持低拷贝, 克隆至BAC 的疱疹病毒基因组随着BAC 而复制, 在每个细菌细胞中保持1~2 个拷贝[4]。BAC-疱疹病毒转染真核细胞产生病毒, 然后可以对它进行表型研究。
为了研究与鼻咽癌相关的EBV 基因功能, 我们从Hammerschidit 研究组引入了最早报道的EBV-BAC基因组(p2089)[5], 在国内首次建立了EBV 感染性克隆技术[6], 同时, 还从鼻咽癌活检组织中克隆了21 个EBV 癌蛋白LMP1 的全长基因序列(GenBank 登录号EF419184~EF419204)。要应用该技术进一步研究基因功能, 关键的步骤之一是在EBV 基因组中引入突变。克隆至BAC 的EBV 基因组大, 不能直接使用常规的酶切和连接等克隆技术引入突变, 必须借鉴在大肠杆菌中操作BAC 载体的一些修饰方法如同源重组。在BAC 操作技术中有2 种同源重组的方法比较常用。一种被称为“两步法”, 由重组蛋白recA 介导重组[7]。这种方法需要1~3kb 的同源臂, 构建穿梭质粒的工作烦琐, 而且效率低, 筛选重组体的过程也费时费力。386 Jianhong Lu et al. /Acta Microbiologica Sinica (2008) 48(3)后来这个方法得到了一些改进[8,9], 现在也仍被应用到BAC-疱疹病毒的突变操作中。White 等[10]使用单独表达的recA 质粒, 精确地用绿色荧光蛋白(GFP)基因替换了BAC基因组中的标记基因dsRed, 这种方法需要经过共整合和两次筛选工作, 优点是没有引入外源序列, 但两端的同源区还是比较长, 分别为750bp 和480bp。另一种方法为“一步法”, 也称ET克隆技术(由重组蛋白ET 介导的重组), 因介导重组的酶不同而具有不同的操作系统[11], 其中redαβγ 系统是效率比较高的一个系统[12]。ET 重组的优点是重组的同源臂短(30~70bp)。本研究通过使用合适的内切酶和方法改进等, 使用一种BAC 技术即ET 重组, 简化了在EBV-BAC 中构建突变体的工作, 减少了外源序列的引入, 并使该方法程序化。这个方法也适应于在EBV 其它基因和基于BAC 的其它疱疹病毒基因组中引入任意突变。 本文将以在p2089 中用NPC 来源、包含LMP1 全长编码区的基因替代相应区域为例详细报道这种方法。
基金项目: 中国博士后基金(20060390264); 湖南省自然科学基金资助项目(05JJ300064); 国家重大科学研究计划(2006CB910504)
*通讯作者。Tel/Fax: +86-731-4805383; E-mail: ligy@xysm.net
**作者简介: 两位作者具有同等贡献。卢建红(1968. ), 女, 湖南醴陵人, 博士后, 研究员, 主要从事病毒分子生物学和肿瘤学研究, E-mail: jianhl@
sohu.com; 唐运莲(1968. ), 女, 湖南衡山人, 博士, 讲师, 主要从事病理学和肿瘤学研究和教学, E-mail: tangyunlian@163.com
收稿日期: 2007-08-28; 修回日期: 2007-10-22
ISSN 0001-6209; CN11-1995/Q
全文下载：在基于BAC 的EB 病毒基因组中引入突变
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