微生物学报Acta Microbiologica Sinica
48(3): 330~336; 4 March 2008
基金项目: 国家自然科学基金(30471292); 国家“863 计划”(2006AA10A206)
*通讯作者。Tel: +86-27-87286974; Fax: +86-27-87281795; E-mail: wub@mail.hzau.edu.cn
作者简介: 赵战勤(1980.), 男, 河南开封人, 博士研究生, 研究方向为细菌分子生物学和基因工程疫苗。E-mail: zhaozhanqin@126.com
收稿日期: 2007-07-06; 修回日期: 2007-12-19
ISSN 0001-6209; CN11-1995/Q
赵战勤, 薛云, 吴斌*, 汤细彪, 陈焕春, 李增强, 胡睿铭, 张建民, 段龙川
(华中农业大学动物医学院, 农业微生物学国家重点实验室, 武汉 430070)
摘要: 【目的】以猪源支气管败血波氏杆菌(Bordetella bronchiseptica, Bb)百日咳杆菌黏附素(PRN)基因的原核表达产物为抗原建立检测PRN 抗体的间接ELISA 方法。【方法和结果】利用谷胱甘肽-S-转移酶(GST)表达系统对PRN 基因在大肠杆菌中进行融合表达。SDS-PAGE 和Western blot 检测证实该基因获得高效表达, 产物易于纯化且具有良好的免疫学活性。通过凝血酶酶切GST-PRN 并回收,获得不含GST 载体蛋白的PRN 蛋白片段。以PRN 蛋白片段为抗原建立检测天然PRN 抗体的间接ELISA 方法。该方法对猪巴氏杆菌病等7 种常见细菌性疾病阳性血清的检测结果均为阴性, 其敏感性比乳胶凝集试验提高4～128 倍, 能检测到人工感染14 d 后的仔猪血清抗体IgG, 对临床送检的1,229 份猪血清的检测阳性率为32.7%。ELISA 方法对阳性猪场的监测结果预示了保育期仔猪的合群导致猪群大量感染支气管败血波氏杆菌。【结论】该方法具有特异性强、敏感性高、重复性好的特点,可用于猪群PRN 抗体水平监测和猪波氏菌病流行病学调查。
关键词: 支气管败血波氏杆菌; 百日咳杆菌黏附素; ELISA
中图分类号: R392 文献标识码: A 文章编号: 0001-6209 (2008) 03-0330-07
支气管败血波氏杆菌(Bordetella bronchiseptica,Bb)可引起猪发生肺炎和非进行性萎缩性鼻炎, 也是猪呼吸道疾病综合症的重要致病因子之一[1]。更重要的是, Bb 的先期感染易于导致其它多种细菌性和病毒性病原, 如多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multicida,Pm)、猪链球菌(Streptococcus suis, S. suis)、副猪嗜血杆菌(Haemophilus suis, HPS)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory Syndromevirus, PRRSV)、猪流感病毒(Swine influenza virus,SIV)等的继发感染, 从而提高猪群呼吸道疾病的发病率和严重程度, 造成较大损失[1-5]。近年来, 人们发现Bb 可经动物传染给人, 并在免疫功能缺陷或低下的人群(如AIDS 患者体内)形成严重感染, 因此引起高度关注[6]。目前, 针对猪波氏菌病诊断方法的报道很少, 主要是细菌学检查、血清学凝集试验、PCR 检测等方法[1]。细菌学检查是通过从肺冲洗物、尸检肺组织及鼻分泌物中进行病原菌的分离、鉴定, 该方法的缺点是操作技术要求较高、过程繁琐、花费时间长。而血清学凝集试验和PCR 检测方法常出现假阳性结果。这是因为, 血清学凝集试验以灭活Bb 菌体为检测抗原, 该抗原易于和巴氏杆菌、链球菌等的血清抗体发生交叉反应[7, 8]; PCR 方法虽然能够检测到Bb 的存在, 但作为一种呼吸道常在菌, Bb 的存在并不一定代表猪群已经发生感染或者发病。因此, 这些方法在临床诊断中并没有得到广泛使用。目前急需一种特异、敏感的猪波氏菌病诊断方法。Bb 具有O、K 和H 抗原, 其毒力因子包括粘附素和毒素两大类。粘附素包括丝状血凝素(filamentous hemagglutinin, FHA)、百日咳杆菌粘附素(pertactin,PRN)、菌毛(fimbriae) 等; 毒素包括皮肤坏死毒素(dermonecrotic toxin, DNT)、气管细胞毒素(tracheal cytotoxin) 、腺苷环化酶溶血素(adenylate cyclase-hemolisin, AC-Hly)等[9]。这些毒力因子的表达与病原所处的环境具有紧密的相关性, 均由BvgA/S 双因子调节系统调节表达。PRN 是由prn 基因编码的一种具有保护性的外膜蛋白成分, 是Bb 感染的重要黏附因子[9, 10]。在猪的感染试验中, 发现不产生PRN 的Bb 菌株不能导致猪发生波氏菌病[11, 12], 且猪群的保护率与PRN 抗体水平呈线性关系 [10, 11, 13], 这就预示着可以通过检测动物体内特异的PRN 抗体来诊断猪波氏杆菌病。本研究利用谷胱甘肽-S-转移酶(GST)表达系统对prn 基因进行了原核表达, 并以表达产物为抗原初步建立了PRN 抗体的间接ELISA 检测方法。
全文下载：猪源支气管败血波氏杆菌百日咳杆菌黏附素基因的原核表达及其抗体检测ELISA 方法
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