微生物学报 4 May 2009, 49(5):591-596
含苏氨酸操纵子重组质粒的构建及其对大肠杆菌L-苏氨酸积累的影响
张雪1,2 ，闫继爱1,2 ，于雷2 ，张国强2 ，张芸2 ，陈宁1 ，温廷益2
1天津科技大学生物工程学院，天津 300457
2中国科学院微生物研究所，北京 100101
摘要：【目的】通过分子生物学手段构建重组质粒，将其转入野生型大肠杆菌W3110，分析含苏氨酸操纵子基因的质粒及质粒定点突变解除反馈抑制时，对 L-苏氨酸积累的影响。【方法】以 W3110染色体DNA为模板，PCR扩增苏氨酸操纵子基因，即启动子THrLp 、编码前导肽基因thrL以及thrA 、thrB 、thrC 基因，通过重叠延伸PCR的方法对thrA 基因定点突变，解除苏氨酸对它的反馈抑制，构建出重组表达质粒pWYE112 和pWYE134,5L发酵实验测定L- 苏氨酸的产量。【结果】经 5L发酵罐发酵产酸实验，W3110 的L-苏氨酸产量为0.036±0.004g/L，携带含苏氨酸操纵子质粒的W3110 菌株L-苏氨酸产量为2.590±0.115g/L ，质粒上thrA解除反馈抑制后，L- 苏氨酸的产量增加到9.223±1.279g/L 。【结论】过表达苏氨酸操纵子基因可以使 L-苏氨酸积累，进一步解除thrA 基因的反馈抑制，可以增强L- 苏氨酸积累的效果，为L- 苏氨酸工程菌改造的进一步研究奠定了基础。
关键词：L-苏氨酸；重叠延伸PCR ；大肠杆菌；发酵；定点突变
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