作者：刘宪玲 徐立 郭建成 肖冰 俞召才 樊代明
单位：刘宪玲 徐立 郭建成 肖冰 俞召才 樊代明（第四军医大学西京医院消化病研究所，陕西西安710032）
关键词：HSP90β；反义核酸；基因转染；Westernblot
摘要：目的 了解HSP90β反义核酸转染细胞中HSP90β蛋白的表达。方法 通过lipofectamine介导将HSP90β反义核酸重组子pcDNA-HSP90转染人胃癌细胞系SGC7901、人胃癌多药耐药细胞系SGC7901/VCR、人肝癌细胞系HCC7402及人食管癌细胞系Ec109。经用G418进行筛选，对筛选出的阳性克隆用Western blot检测HSP90β蛋白的表达。结果 pcDNA-HSP90转染人胃癌细胞系SGC7901，人胃癌耐药细胞系SGC7901/VCR，人肝癌细胞系HCC7402及人食管癌细胞系Ec109后，用G418筛选出的阳性克隆，分别被命名为:AH-SGC7901，AH-SGC7901/VCR，AH-HCC7402及AH-Ec109。Westernblot检测结果表明，AH-SGC7901，AH-SGC7901/VCR，AH-HCC7402及AH-Ec109表达的HSP90β蛋白低于其亲本细胞。结论 HSP90β反义核酸可封闭HSP90βmRNA，使p
cDNA-HSP90转染的细胞AH-SGC7901，AH-SGC7901/VCR，AH-HCC7402及AH-Ec109表达的HSP90β蛋白减少，为研究HSP90下调对肿瘤细胞生 物学活性的影响提供了实验材料。
中图号：Q78 文献标识码：A
文章编号：1007－8738(2000)02－0124－04
The expression of HSP90β protein in HSP90β antisense RNA vector- transfected cells
LIU Xian- ling XU Li GUO Jian- cheng XIAO Bing YU Zhao cai FAN Dai- ming
（Institute of Digestive Disease, Xijing Hospital, Fourth Military Medical University, Xi'an 710032, Shaanxi Province,China）
Abstracts: Aim To evaluate the expression of HSP 90β protein in HSP 90β antisense RNA vector- transfected cells. Methods pcDNA- HSP90 of HSP90β antisense RNA recombinant was transfected through mediation of lipofectamine into human gastric cancer cell line SGC7901, MDR- type human gastric cancer cell line SGC7901/VCR, human hepatic cancer cell line HCC7402 and human esophageal cancer cell line Ec109. Positive clones were selected with G418. The expression of HSP- 90β protein was assayed by Western blot. Results G418 screened positive clones from pcDNA- HSP90 transfected cells were named AH- SGC7901, AH- SGC7901/VCR,AH- HCC7402 and AH- Ec109 respectively. Western blot showed that the expression of HSP90β protein in AH- SGC7901, AH- SGC7901/VCR, AH- HCC7402 and AH- Ec109 cells was lower than that in their parental cells. Conclusion The expression of HSP90β protein in AH- SGC7901, AH- SGC7901/VCR, AH- HCC7402 and AH-Ec109 cells was decreased owing to the blocking roles of HSP90β antisense RNA to HSP90 mRNA in those cells. This supplied experimental materials for studying the effects of the down- regulation of HSP90β on biological activity of tumor cells.
Keywords: HSP90β ； antisense RNA;gene transfection; Western blot
HSP90为生物进化过程中一种高度保守的胞浆蛋白质，约占胞浆蛋白的1％～2％。HSP90在体内多为二聚体。在较高等的真核生物体内，HSP90有两种，即α型和β型，两者分别由730和724个氨基酸组成，其同源性为84％。它们分别由不同的基因编码。HSP90α与HSP90β为组成型表达，应激（如高温、感染）可诱导其生成增加，诱导因素不同，对α及β的诱导有所不同。相比之下，HSP90α易受热诱导，而HSP90β易受有丝分裂原诱导。
近年发现，HSP90与肿瘤关系较密切[1－3]。肿瘤细胞中HSP90的表达比正常细胞高2～10倍。HSP90α可通过调节细胞周期促进细胞增殖，HSP90β能够抑制细胞凋亡与分化[4，5]。最近有人报道，HSP90β还与P-gp的表达有关[6]。本研究拟用HSP90β反义核酸载体转染人胃癌细胞系SGC7901及其多药耐药细胞系SGC7901/VCR、人肝癌细胞系HCC7402和人食管癌细胞系Ec109，以建立HSP90β蛋白的低表达细胞系,为进一步研究HSP90β对消化系肿瘤细胞生物学活性的影响，以及HSP90β与耐药的关系提供实验材料。
1 材料和方法
1．1 材料 人胃癌细胞系SGC7901从军事医学科学院毒物研究所引入。人胃癌多药耐药细胞系SGC7901/VCR由本研究所提供。人肝癌细胞系HCC7402由本校病理学教研室提供。人食管癌细胞系Ec109由本校生物化学教研室提供。HSP90β反义核酸重组子pcDNA-HSP90由作者等[7]构建。pcDNA3.1(＋)由美国杨静华提供。Lipofactamine，G418，RPMI1640（Gibco公司）。小牛血清（浙江金华公司）；山羊抗人HSP90β多克隆抗体(美国Santa Cruz Biotechnology，Inc)，生物素化的兔抗山羊IgG，SABC试剂盒(武汉BosterInc)；DAB（华美公司）；三去污剂裂解缓冲液[50mmol/LTris·ClpH8.0，150mmol/LNaCl，0.2g/L叠氮钠，1g/LSDS，100mg/LPMSF（Sigma公司），1mg/Laprotinin（Sigma公司），10g/LNP-40及5g/L去氧胆酸]；丙烯酰胺，N，N-亚甲双丙烯酰胺（上海华美公司）；TBE（89mmol/LTris-硼酸；2mmol/LEDTA）；100g/L过硫酸铵；100g/LSDS；TEMED（Sigma公司）；Tris-甘氨酸工作液（25mmol/L Tris碱，250mmol/L甘氨酸
，1g/LSDS）；2×SDS凝胶加样缓冲液（100mmol/LTris·ClpH6.8，200mmol/LDTT，40g/LSDS，2g/L溴酚蓝，200mL/L甘油）；电转移缓冲液（39mmol/L甘氨酸，48mmol/LTris碱，0.37g/LSDS，200mL/L甲醇 ）及四氯萘酚（上海华美公司）。
1.2 方法
1.2.1 重组质粒的转染及阳性克隆的筛选 实验组转染pcDNA-HSP90；空载体对照组转染pcDNA3.1(＋)。SGC7901，SGC7901/VCR，HCC7402和Ec109细胞作为相应的空白对照组。以碱裂解法提取重组质粒pcDNA-HSP90，经PEG纯化。用lipofectamine介导基因的转染（按说明书进行）：即在接种于6孔板中的细胞达到80％融合时，用无双抗、无血清RPMI1640培养液洗涤细胞，加入质脂体包裹的质粒，37°C50mL/LCO2培养6h。然后，更换用含100mL/LFBS的RPMI1640液继续培养48～72h后，加入G418（400mg/L）进行抗性筛选。3～4wk后，见有抗性细胞集落形成时，挑选细胞克隆，用含100mg/LG418的100mL/LFBS-PRMI1640液扩大培养。其中pcDNA-HSP90转染组经G418筛选出的克隆，分别被命名为:AH-SGC7901，AH-SGC7901/VCR，AH-HCC74O2及AH-Ec109。pcDNA3.1（＋）转染组筛选出的克隆，分别被命名为：SGC701-pcDNA，SGC7901/VCR-pcDNA，HCC7402-pcDNA及Ec109-pcDNA。
1.2.2 培养细胞的裂解及蛋白定量 细胞接种于直径90mm的平皿，于37°C，50mL/LCO2饱和湿度下培养至细胞长满平皿。取出平皿，用冷PBS洗2次，加入预冷至0°C的三去污剂裂解缓冲液1mL裂解细胞，用移液枪将细胞碎片移入一只Ep管中，同时加入10μLPMSF，置4°C30min，离心(12000r/min)2min。取上清，分装于Ep管中，于－20°C保存备用。同时，取少许用Photometrey分 析仪进行蛋白定量。?1.2.3HSP90β蛋白表达的检测取各种细胞裂解液，调整含量后每样品上样10μL，进行SDS－PAGE及免疫印迹。于NC膜上依次加入山羊抗人HSP90β一抗（1∶100）室温作用2h，及辣根过氧化酶标记的驴抗山羊IgG（1∶500）室温作用1h。PBS洗涤后，用四氯萘酚显色并拍照。用Quantimet570(Germany,LeicaInc.)图象分析仪（QUIC图象系统）对免疫印迹的结果进行半定量分析。条带的染色强度以灰度值表示（256级灰度，黑色的灰度值最小为0 ，白色的灰度值最大为255）。
2 结果
2．1 阳性克隆的筛选 pcDNA-HSP90载体转染SGC7901，SGC7901/VCR，HCC7402及Ec109细胞后，用G418进行筛选。对筛选出的相应阳性克隆，分别命名为：AH-SGC7901，AH-SGC7901/VCR，AH-HCC74O2及AH- Ec109（图1）。
图1 pcDNA-HSP90转染的细胞经G418筛选出的阳性克隆
Fig1 pcDNA-HSP90 transfected positive clones selected with G418
1：AH-SGC7901；2：AH-SGC7901/VCR；3：AH-HCC74O2；4：AH-Ec109.
2.2 HSP90β蛋白的表达 将Western blot的结果用Quantimet 570图象分析仪进行分析（图2）。结果表明，SGC7901细胞与SGC7901－pcDNA细胞的平均灰度值为61.4±2.4及61.2±3.3,二者无显著差异(P＞0.05)；AH-SGC7901细胞的平均灰度值为83.2±2.9,明显大于前两者(P＜0.05)，即AH-SGC7901细胞中HSP90β蛋白的表达明显低于其亲本细胞及其空白对照细胞。SGC7901/VCR细胞与SGC7901/VCR-pcDNA细胞的平均灰度值分别为37.5±3.7及38.9±3.3,二者无显著差异(P＞0.05);AH-SGC7901/VCR细胞的平均灰度值为80.5±3.6,明显大于前两者(P＜0.05)，即AH-SGC7901/VCR细胞中HSP90β蛋白的表达，明显低于其亲本细胞及其空白对照细胞。HCC7402细胞与HCC7402－pcDNA细胞的平均灰度值分别为93.5±3.4及89.1±3.5, 二者无显著差异(P＞0.05);AH-HCC7402细胞的平均灰度值为156.8±2.8,明显大于前两者(P＜0.05)，即AH-HCC7402细胞中HSP90β蛋白的表达，明显低于其亲本细胞及其空白对照细胞。Ec109细胞与Ec109－pcDNA细胞的平均灰度值分别为81.8±4.0及81.2±3.3,二者无显著差异(P＞0.05);AH-Ec109细胞的平均灰度值为103.2±4.2,明显大于前两者(P＜0.05)，即AH-Ec109细胞中HSP90β蛋白的表达，明显低 于其亲本细胞及其空白对照细胞。
图2 pcDNA-HSP90转染细胞中HSP90β蛋白的表达
Fig2 HSP90β protein expression in pcDNA-HSP90 transfected cells
1：SGC7901；2：SGC7901-pcDNA；3：AH-SGC7901；4：SGC7901/VCR；
5：SGC7901/VCR-pcDNA；6：AH-SGC7901/VCR；7：HCC7402；
8：HCC7402-pcDNA；9：AH-HCC7402；10：Ec109；11：Ec109-pcDNA；
12：AH-Ec109;M:Marker(Mr).
3 讨论
基因转染的方法很多,如磷酸钙－DNA共沉淀法、脂质体转染法、受体介导的基因转染法、电穿孔法,基因枪注射法及利用病毒包装细胞转染法等。脂质体介导的基因转染[8]的作用机制是：脂质体首先与DNA形成复合物，该复合物与细胞膜接触、融合，通过细胞内吞作用，使DNA转入真核细胞内。Lipofectamine为Gibco公司生产的第3代多价阳离子脂质体，其转染效率明显高于其它单价阳离子脂质体，如lipofectin和lipofectACETM等。一些实验表明，应用lipofectamine转染外源基因，具有转染效率高、特异性强、无感染性、无免疫原性，并具有方法简单、容易操作等优点，因此，是一种简便、安全有效的基因转染方法。我们应用lipofectamine成功地将反义HSP90β基因转染入SGC7901，SGC7901/VCR，HCC7402及Ec109细胞。利用真核表达载体中含有的新
霉素抗性基因Neo，用G418进行抗性筛选，筛选出的相应阳性克隆分别为AH-SGC7901，AH-SGC7901/VCR，AH-HCC7402和AH-Ec109。反义RNA（anti-senseRNA）是指与mRNA互补的RNA分子。这种反义RNA能与mRNA分子特异性结合，抑制该mRNA的翻译，是原核细胞中基因表达与调控的一种方式。反义核酸技术是通过人工合成反义RNA的基因，并将其导入细胞内，转录出反义RNA，封闭其翻译，抑制特定基因的表达，阻断该基因的功能。我们曾研究表明，AH-SGC7901，AH-SGC7901/VCR，AH-HCC7402及AH-Ec109细胞有HSP90β反义RNA的表达[9]。Westernblot检测表明，与亲本细胞及转染空载体的细胞相比较，HSP90β反义核酸转染的细胞AH-SGC7901，AH-SGC7901/VCR，AH-HCC7402及AH-Ec109中，HSP90β蛋白的表达较其亲本细胞明显减低，也说明AH-SGC7901，AH-SGC7901/VCR，AH-HCC7402及AH-Ec109细胞有HSP90β反义RNA的表达。由于部分封闭HSP90mRNA,从而使其翻译为HSP90β蛋白的量减少。总之，由于HSP90β反义核酸重组子pcDNA-HSP90转染的AH-SGC7901，AH-SGC7901/VCR，AH-HCC7402及AH-Ec109细胞中，HSP90β蛋白的表达低于其亲本细胞，为进一步研究HSP90β对消化系肿瘤细胞生物学活性的影响及其与耐药的关系等建立了细胞模型。
基金项目：国家自然科学基金资助，No.39570806; 国家杰出青年基金资助，No.3952020.
作者简介：刘宪玲,女,36岁,主治医师,讲师，博士 西安市长乐西路15号，Tel.(029)3375226Email.isabelliu412@yahoo.com
参考文献:
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