十、扫描玻片和数据处理
杂交后应获取针对实验所用2种荧光染料的微阵列荧光图像。我们使用的装置是激光扫描共聚焦显微镜(扫描仪)。扫描仪有一个激光管(或一组激光管)，可以产生与所用荧光染料激发光谱相应的某一波长激光。激光穿过一标准物镜照亮玻片上的一个点，激发荧光被物镜聚集后又穿过一系列滤镜(以去除激发光波)、一个校准透镜和一个极小孔眼(以降低噪音，这使得它成为一个共聚焦装置)，并在一个光电倍增管中进行计量。激光束快速扫描玻片后获得微阵列的一幅光栅图像。用一对galvanometer将光束定位于固定玻片上的各个点，或用泛光照射源和CCD镜头，也可获得相似图像。我们发现共聚焦扫描装置所获结果最好，因为其信噪比优于galvanometer或CCD。
如前所述，实验最终目标是测定玻片上每一点的两种荧光染料的相对信号值。有多种方法可以完成这一任务，最常见者是将图像栅格化，然后计算每方格中每种荧光染料的平均荧光强度，两样品中基因相对含量就变成了两种荧光信号强度的比值。这种计算可能会受诸如对大多数阵列可见到的非零荧光背景进行补偿计算的影响。我们开发了相应软件，可运用多种算法准确估算背景值，并用更复杂的算法直接测定相对荧光强度比值。这个会和计划中的价格不贵的共聚焦扫描仪一起面市。
十一、点样问题
用到DAN微阵列的实验会在任一步骤中遇到技术问题，而由微阵列提供的加入多种内参照方法将有助于识别和校正许多问题。确实，甚至有严重瑕疵的实验也常提供足够多的有用新信息。明智的实验设计是，只要有可能，就应安排实验的每一步骤都能重复而无需重复整个实验，例如多准备些mRNA和玻片阵列，应多于实际需要量，这就是聪明之举。
十全十美的阵列图像是罕见的。我们碰到的许多问题很难追踪原因，而且在阵列扫描之前无法用可检测手段证明这些原因。我们建议在杂交珍贵样品前设立多级质量控制。成批的左旋多聚赖氨酸修饰玻片应加以质检，可取小量修饰好的玻片进行点样并测试整个后处理和杂交过程。只有小量玻片测试成功，同一批次的大量玻片才用于真正的点样。一旦玻片点样后，应对小量点样玻片进行后处理，后处理是否成功可用已知应产生良好结果的RNA制备的探针进行测试来判定。最后，所有阵列在杂交前应扫描一次，弃去那些有明显污点的玻片(划伤或任何影响左旋多聚赖氨酸修饰的因素均可被检测为微阵列上的背景荧光)，并弃去那些杂交前背景就高的阵列。左旋多聚赖氨酸和其它修饰物在对应于Cy3波长激发光下会发弱荧光，由于一些未知原因这种荧光在玻片之间有变异，偶尔强度达到能干扰杂交信号。另外，样点上的DNA在此激发波长下也会发出弱荧光且在玻片之间有变异。如果这些杂交前荧光信号源中的任一种的强度处于或接近杂交玻片上的信号，就应弃去这些阵列。以下讨论最常见问题(见图5)中的某一些。
样点的形状问题：一个常见问题就是部分或所有点有“彗星尾”，任一点的拖尾与其它点的拖尾方向一致，样点的颜色也反映在拖尾中。这一现象可能由于没有完全而快速地将玻片浸没在Succinic Anhydride封闭液中所致。使从样点洗脱的DNA又结合到玻片上。若拖尾的样点彼此是分离的，这些有彗星尾的玻片依然是可用的。与样点总体外观有关的另一现象是“面包圈孔”。按前述方法用点样针点样时，它并不是留下一个均一的圆，较多物质滞聚在样点的外围部分，就使得中央部分相对空当。这一现象可由延长再次水合化时间来解决。再次水合化时间再次延长些，那么彗星尾、面包圈孔就不会让一张玻片浪费，实际上只是稍稍在数据质量上作了一点妥协。
高背景：由于异常的高荧光背景而导致的芯片模糊是常见的问题。高背景即可出现在整个芯片的杂交表面，也可出现在一个局部区域。我们可以估计高背景的可能来源，但要确切地查明某种高背景的来源是困难的。在试图判断高背景问题时，弄清高背景在玻片上的位置是十分重要的。如果在杂交前预先系统地扫描芯片，覆盖整个芯片的明显高背景是可以避免的。高背景局限于杂交区，说明标记的探针粘着于玻片表面，在洗片步骤时没有被冲洗掉，导致这一结果有两种可能性，一是poly-lysine的氨基基团封闭不足，或是在杂交中标记的探针非特异吸附。这种来源的高背景通常伴随着“anti-probe”现象，此高背景只出现在非样点区域，这很可能反映出这一区域的poly-lysine容纳点片DNA能力降低。在某种情况下，芯片的一边背景较差，提示与玻片在液体媒介（最可能是封闭液）中被如何放置有关。通常高背景易出现在盖玻片的边缘，可能提示探针在杂交中脱水析出，这一问题可通过在杂交舱中加多点3× SSC，并确保封好杂交舱而得以解决。均一的高背景也可能是由于探针制备不好导致，因为小的探针片段或不合格的荧光核苷结合在表面引起高背景却不影响杂交信号。
局部信号微弱：大部分高背景现象都伴随特异性信号减弱，因为探针的信号被芯片表面的高背景所掩盖。然而，不伴有高背景的信号微弱也可能发生，经验认为这是因为这一区域探针层太薄而引起的。芯片或／和盖玻片表面的气泡和不匀质也能引起这种结果。仔细选择和放置玻片与盖玻片可减少这个问题。
结论
MICROARRAY是在基因组范畴内进行探索、研究的有力工具。多年来生物学家已经能研究少量条件下的大量基因或多种条件下少量基因的差异表达。基因芯片第一次使上千种条件下研究成千上万个基因成为可能。对于那些基因组序列已知的生物体（如Saccharomyces Cerevisiae）这一技术使同时研究其所有基因表达成为可能。对于人类，应用同样方法的唯一局限性就是需要已知基因的数据；人类完整的转录物鉴定和测序将在以后几年完成。过去，由于实验工具的局限迫使大部分基因表达类型的设计仅徘徊于某种假设，和被限定于我们有限知识的基础上。而现在我们可以设计实验去系统地探索生物学广大的未知领域。作为研究工具的MICROARRAY的实用性就在于它的灵活简便及价格低廉。所以在我们研发这项技术的种种可能的改变时，注重它的研究目标、简便性和低廉性，在我们改进这项技术时，应本着尽可能降低它在经济、使用和心理方面障碍的原则，以使一个独立的实验室在一年内就能完成基因组范围内成千上万个基因研究。
拥有点样机、扫描仪的独立实验室可以在一年内进行某种条件下成百万个不同基因的表达或其特征的检测。这一史无前例的收集大量基因表达信息的技术发展速度惊人，以至于出版、分发、保存的机制和相应标准的建立速度尚无法赶上研究所产生结果的速度；另外整理、观察、解释大量信息的分析软件仍处于发展的初级阶段。但这不会成为基因表达和其他功能研究的阻碍，这一新的前沿技术给生物领域的开拓者展现出了新的挑战机遇。
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