小RNAs如何进入哺乳动物细胞？
一切开始于花：上个世纪90年代挪威的研究人员发现在矮牵牛（petunias）中有一种特殊的基因的额外拷贝可以抑制其活性，而不是如之前假想的增强其活性。几年之后这种基因研究发现其机制基于细胞中mRNA的降解，最终在90年代末期诺贝尔获得者Andrew Fire和Craig Mello建立了RNA干扰（RNA interference，RNAi）技术解决了这一问题：利用双链RNA特异有效关闭基因。科学家们利用秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans，简称C. elegans）进行研究，但是之后Fire和Mello在利用RNAi传递进脊椎动物的时候出现了许多问题。尤其是小RNAs，即siRNAs（small interfering RNAs），在动物操作中十分困难。虽然利用不同的方法，比如高压喷射（high-pressure injections）或者胆固醇协力，可能可以成功传递siRNAs，但是其机制至今并不清楚。
来自苏黎世联邦理工学院(ETH Zürich)分子系统生物学研究院的教授Markus Stoffel，与Alnylam公司合作，成功阐明了哺乳动物中与脂肪酸结合的siRNA如何被吸收的机制。这一研究文章最早公布在Nature Biotechnology网站上，同时将以siRNA治疗可能性的内容出现在11月印刷版上，因为Sotffel表示siRNA能与不同的脂肪酸有效结合。
胆固醇转运子（transporters）扮演着重要角色
Stoffel和他的研究团队将目光转移到胆固醇修饰siRNA上，并不是因为基于这种复合物的这种方法特别有效，而是因为这种方法副作用小。所有的研究人员首先希望知道siRNA是否能被绑定到出来胆固醇以外的其它疏水亲脂性物质上，从而能同时减少肝脏的一个靶基因的活性。结果证明有几种这样的脂肪酸（fatty acids），但是到底血液中这些RNAs结合的所谓的疏水亲脂物质是什么呢？
苏黎世联邦理工学院的研究人员通过脂肪酸研究发现，这些结合的partners就是鼎鼎有名的胆固醇转运蛋白：高密度脂蛋白(high density lipoprotein, HDL)和低密度脂蛋白（ Low Density Lipoprotein，LDL），以及血液中随处可见的血清白蛋白（albumin）。如果没有这些脂蛋白离子，那么siRNAs就无法被吸收入组织中。
在另一项研究中，科学家证明如果siRNA-脂肪酸分子在实验之前已经牢固的结合到了HDL和LDL上，就能更加有效被吸收，Stoffel研究小组也发现一个siRNA-脂肪酸分子是结合到HDL上还是LDL上，会影响这种吸收的特异性，会传递到不同的组织：所有LDL复合物启动肝脏的反应，而HDL复合物则在肠或肾中起作用。
一个令人气愤的发现
后一个发现说明siRNA吸收需要HDL和LDL受体，研究人员通过失活这些受体证明这一假设，结果发现受体失活后，siRNA就不能被传递吸收。尽管获得了这些研究结果，但是Stoffel还是感到有一些气愤——他发现很难想象这些siRNA通过如HDL一般正常的吸收途径进入细胞，因为这一路线将会引入细胞自身的消化系统，其中的溶酶体会把siRNAs降解。那么这些siRNAs如何能避开这种降解呢？Stoffel认为siRNAs可能利用了一种不同的入口进入细胞，因此HDL和LDL受体只在停靠位（docking station）而不是入口处起作用。
但是这一不同的入口是什么呢？苏黎世联邦理工学院的研究人员想起了一个线虫细胞siNRA吸收必需的基因产物：Sid1，在哺乳动物中也有一个这一基因的同源异型体（homologue）。研究人员将这一基因失活，发现在哺乳动物中Sid1也是必需的。整个发现获得了一个完整siRNA机制，从开始与特异脂肪酸结合，到连接到疏水性蛋白上，传递至组织细胞中。
研究与治疗的前景
Stoffel认为通过他们的工作，能确定出siRNA吸收机制中最重要的元素，然而他也表示也有可能更多的分子在其中扮演了重要的角色。但是由于这是第一次深入研究这一机制，因此很有可能促进这一技术的快速发展。比如，Stoffel研究团队想要了解HDL和LDL是否能被合成蛋白或富集脂质粒子所替代，这样这一技术就可以用于基因治疗中。
而且siRNA doors的确定也开启了基础研究的新方法——也许可以用miRNAs替代siNRA，同样的机制对于miRNA抑制子而言也应该有效。由于越来越多的研究人员认为miRNA在基因调控中发挥了一个决定性的作用，因此miRNA的靶向及抑制也许通过这一研究结果能获得进一步的发现。
原始出处:
Nature Biotechnology
Published online: 16 September 2007 | doi:10.1038/nbt1339
Mechanisms and optimization of in vivo delivery of lipophilic siRNAs
Christian Wolfrum1,2,3, Shuanping Shi3, K Narayanannair Jayaprakash4, Muthusamy Jayaraman4, Gang Wang4, Rajendra K Pandey4, Kallanthottathil G Rajeev4, Tomoko Nakayama4, Klaus Charrise4, Esther M Ndungo3, Tracy Zimmermann4, Victor Koteliansky4, Muthiah Manoharan4 & Markus Stoffel1,2,3
Abstract
Cholesterol-conjugated siRNAs can silence gene expression in vivo. Here we synthesize a variety of lipophilic siRNAs and use them to elucidate the requirements for siRNA delivery in vivo. We show that conjugation to bile acids and long-chain fatty acids, in addition to cholesterol, mediates siRNA uptake into cells and gene silencing in vivo. Efficient and selective uptake of these siRNA conjugates depends on interactions with lipoprotein particles, lipoprotein receptors and transmembrane proteins. High-density lipoprotein (HDL) directs siRNA delivery into liver, gut, kidney and steroidogenic organs, whereas low-density lipoprotein (LDL) targets siRNA primarily to the liver. LDL-receptor expression is essential for siRNA delivery by LDL particles, and SR-BI receptor expression is required for uptake of HDL-bound siRNAs. Cellular uptake also requires the mammalian homolog of the Caenorhabditis elegans transmembrane protein Sid1. Our results demonstrate that conjugation to lipophilic molecules enables effective siRNA uptake through a common mechanism that can be exploited to optimize therapeutic siRNA delivery.
Institute of Molecular Systems Biology, Swiss Federal Institute of Technology, ETH Zürich, HPT E73.
Competence Center of Systems Biology and Metabolic Diseases, ETH Zürich, CH-8093 Zürich, Switzerland.
The Rockefeller University, 1230 York Avenue, New York, New York 10021, USA.
Alnylam Pharmaceuticals Inc., 300 3rd Street, Cambridge, Massachusetts 02142, USA.
Correspondence to: Markus Stoffel1,2,3 e-mail: stoffel@imsb.biol.ethz.ch
