人类的历史，某种程度上就是与细菌不断“斗争”的历史。然而，我们并未“知己知彼”。
近日，北京生命科学研究所高级研究员邵峰及其科研团队在世界上首次发现了细菌毒素蛋白可以直接修饰泛素蛋白的致病机制。该机制的发现将为抗菌类新药的研发提供理论基础和策略性的提示，这对掌握和了解病原细菌致病机理和建立有效防治手段有重要意义。美国Science杂志日前在线发表了这一成果。
众所周知，生物体是一部程序精准、分工明确的“复杂机器”。在生物体内，被称为泛素的一类蛋白，主要负责将老化和即将废弃的蛋白质贴上“死亡标签”，然后把其运送到细胞体内的“垃圾桶”中，切割成较小的片段毁坏或重新加以利用。这一信号途径在生物体中非常重要，如果该信号系统被破坏，细胞将无法行使正常功能，器官也不能正常运转。
因此，对泛素分子的研究一直是生物科学领域的前沿和热点。邵峰团队首次发现了病原细菌的毒素效应蛋白可直接共价修饰宿主泛素蛋白本身，从而导致泛素和泛素类蛋白失活，使宿主体内的泛素信号系统功能紊乱的机制。
不仅如此，邵峰团队还开创了利用细菌毒素蛋白研究泛素信号系统的新视角。在这一发现中，他们不仅提出了细菌通过分泌毒素效应蛋白致病的最新机制，还对宿主细胞的泛素蛋白信号通路有了新的认识和了解。
“我们主要致力于细菌致病机理的研究，不过这不是唯一目的。不同的病原体为我们深入研究宿主自身的信号通路提供了独特的视角和窗口。”邵峰说，亿万年来，为了生存，细菌需要不断适应宿主，它们和宿主共同进化。他们目前的工作正是希望从“敌人”那里了解“自己”，将不同种属的病原细菌、细菌突变株以及细菌的毒素蛋白作为工具，来阐述宿主细胞自身的机理。
“这些成功还取决于拥有多方向多种类的实验手段。我们整合生物化学、细胞生物学、遗传学以及结构生物学等多种实验方法，从不同的角度探索和解决同一个科学问题。”邵峰介绍说，“下一步，我们还将继续研究被病原菌修饰的泛素信号通路发生功能紊乱的深入机理；并将以不同的病原菌作为研究工具，系统地阐述宿主抵抗侵染和发生炎症的信号转导机制。”这可能为设计抗炎症药物提供新的预测靶点和理论启示。
2010年8月5日，我所邵峰博士实验室在Science 杂志(Science Express)发表题为“Glutamine deamidation and dysfunction of ubiquitin/NEDD8 induced by a bacterial effector family”的文章。该文章报道了病原细菌效应蛋白通过直接共价修饰并失活宿主细胞中的泛素和泛素类蛋白从而导致宿主泛素信号通路发生功能紊乱的新的致病机制。
通过三型分泌系统分泌效应分子进入真核细胞内，进而阻断或调节宿主关键信号转导通路是许多病原菌普遍采用的致病机制。寻找效应分子在宿主细胞中的靶蛋白并阐明其作用于靶蛋白及相关信号通路的生物化学机理对我们了解病原菌致病机理和建立有效防治手段有着重要的意义。同时，这也可能促进我们对真核细胞本身信号转导机制的进一步理解。
来自类鼻疽杆菌(Burkholderia pseudomallei)的CHBP和来自致病性大肠杆菌（Enteropathogenic E. coli）的Cif是一类具有木瓜蛋白酶催化结构域的三型分泌效应蛋白，这类效应分子具有阻断宿主细胞周期的活性。在这项研究中，邵峰小组首先发现CHBP具有很强的抑制真核细胞的泛素链形成（ubiquitination）的活性，这种活性依赖于CHBP的类木瓜蛋白酶的催化活性。一系列的生化实验分析揭示了泛素（ubiquitin）蛋白第40位的谷氨酰胺（Gln-40）在CHBP的作用后发生了脱氨反应，变成了谷氨酸。因此，CHBP性质上是一个泛素脱氨酶（deamidase）。利用分子生物学的方法直接将泛素的Gln-40突变为谷氨酸后，不管是在体外还是在细胞内，这样的突变泛素分子都丧失了形成泛素链的活性。在进一步检测了CHBP是否也作用其他泛素类蛋白时，邵峰小组发现CHBP能够，也只能够对一个叫做NEDD8的泛素类蛋白起同样的脱氨修饰作用，并且活性要更强一些。在Burkholderia的感染宿主细胞的实验中，他们也验证了通过三型分泌系统分泌的CHBP能够导致宿主细胞中几乎所有的NEDD8和大约一半的泛素分子发生脱氨化修饰。
有趣的是，当用带有Cif的致病性大肠杆菌感染宿主细胞时，他们发现NEDD8被完全修饰，而泛素却一点都没有。这与体外观察到的Cif对NEDD8有很强的偏好性是一致的。在感染的细胞中，只有受Cullin泛素连接酶复合物调控降解的底物蛋白的泛素化和降解受到了明显的抑制作用。NEDD8的功能是和Cullin蛋白发生类似于单泛素化的共价修饰（这个修饰作用也被叫做neddylation）。已知NEDD8修饰可以大大增强Cullin泛素连接酶复合物的活性，但令人吃惊的是，当Cullin分子被经过脱氨的NEDD8修饰后，其泛素连接酶活性不仅没有被上调，反而却受到了极大的抑制。这个结果完美地解释了体内观察到的Cullin底物泛素化和降解受到特异性抑制的现象。更进一步，在真核细胞中直接异位表达脱氨化的NEDD8能够模拟致病性大肠杆菌的感染作用，这些作用包括Cullin底物的特异性积累，细胞周期运转受到抑制，以及细胞出现很强的应力纤维。事实上，应力纤维的出现正是由于邵峰实验室此前的研究中发现的CUL3/BACURD泛素连接酶复合物（Chen et al., Molecular Cell, 2009）在NEDD8被脱氨后，其泛素化和降解RhoA的功能受到了抑制。
这项研究揭示了一种全新的、通过分泌效应蛋白直接修饰宿主中泛素和泛素类蛋白（NEDD8）从而阻断宿主泛素化通路的病原菌致病机制。更为重要的是，这种对泛素和NEDD8的特异性脱氨修饰也为我们研究蛋白质泛素化的机制（为何Gln-40脱氨化的泛素不能在泛素连接酶催化下成泛素链）以及NEDD8是如何活化Cullin泛素连接酶的生物化学机制研究提供了一个新的、独特的研究途径和思路。这项研究也有力地说明对病原菌效应蛋白的研究可以为我们了解真核本身的细胞生物化学机制提供独特的角度，有着重要的意义。
博士研究生崔霁欣为本文第一作者；研究生姚庆和李珊对本项研究也有重要贡献；其他参与此项工作的还有邵峰小组的陆秋鹤博士和技术员柳丽萍；蛋白质组中心的丁小军和陈涉也参与了部分研究工作；本研究也得到了华盛顿大学的毛海滨博士和郑宁教授的帮助；邵峰博士为本文通讯作者。
此项研究为科技部863和北京市科委资助课题，完全在北京生命科学研究所完成。（生物谷Bioon.com）
生物谷推荐原文出处：
Science DOI: 10.1126/science.1193844
Glutamine Deamidation and Dysfunction of Ubiquitin/NEDD8 Induced by a Bacterial Effector Family
Jixin Cui,1,2 Qing Yao,2 Shan Li,2 Xiaojun Ding,2 Qiuhe Lu,2 Haibin Mao,3 Liping Liu,2 Ning Zheng,3,4 She Chen,2 Feng Shao2,*
A family of bacterial effectors including CHBP from Burkholderia pseudomallei and Cif from Enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) adopt a functionally important papain-like hydrolytic fold. We show here that CHBP was a potent inhibitor of the eukaryotic ubiquitination pathway. CHBP acted as a deamidase that specifically and efficiently deamidated Gln-40 in ubiquitin and ubiquitin-like protein NEDD8 both in vitro and during Burkholderia infection. Deamidated ubiquitin was impaired in supporting ubiquitin-chain synthesis. Cif selectively deamidated NEDD8, which abolished the activity of neddylated Cullin-RING ubiquitin ligases (CRLs). Ubiquitination and ubiquitin-dependent degradation of multiple CRL substrates were impaired by Cif in EPEC-infected cells. Mutations of substrate-contacting residues in Cif abolished or attenuated EPEC-induced cytopathic phenotypes of cell cycle arrest and actin stress fiber formation.
1 Graduate Program in Chinese Academy of Medical Sciences and Beijing union Medical College, Beijing 100730, China.
2 National Institute of Biological Sciences, Beijing, 102206, China.
3 Department of Pharmacology, Box 357280, University of Washington, Seattle, WA 98195, USA.
4 Department of Pharmacology and Howard Hughes Medical Institute, Box 357280, University of Washington, Seattle, WA 98195, USA.
