宋麟祥
(工研院生医中心生医材料暨组织/工程技术组研究员)
■一、前言
组织工程是生物医学工程领域中一个快速发展的分支，它融合了细胞生物学和工程学的原理，目的在开发具生物活性的组织替代物，期能修复受损组织或是再生。由于组织工程对象是人体组织，细胞和组织块之体外培养条件必须仿生地接近人体内环境，因此生物反应器即为良好的应用工具，除在种子细胞增殖、组织块建构培养扮演重要角色外，生物反应器尚能控制pH、溶氧、机械应力、营养供给及代谢物移除等条件，为细胞的生长、分化和发育分化提供最适宜的环境。本文将介绍组织工程生物反应器的应用进展与开发前景。
■二、种子细胞、组织块与生物反应器
(一)种子细胞扩增
使用组织工程种子细胞须考虑三个重点：(1)适当的细胞密度(即单位体积所需细胞数量)。Goshima等(1)将体外培养的骨髓间充质干细胞，按不同密度复合于多孔陶瓷植入体内，结果显示植入物的骨髓间充质干细胞密度须在2×107/cm3以上才能确保新骨形成。另外，当软骨细胞植入的密度低于1×107/cm3个时，会产生很少软骨或软骨无法生成(2)，可见种子细胞密度对培养的影响性。(2)良好的种子细胞分化程度。单层培养造成细胞去分化，并容易形成细胞团，造成细胞形态变为细长，不具备块状组织的生理特征，产生的ECM量少且质量差。虽然培养在三维支架后，细胞分化状态可部分恢复，但往往恢复不完全，因而直接影响组织块的质量(3)。(3)控制种子细胞扩增培养条件。如神经干细胞可以在微重力条件下，维持圆形的细胞形态进行扩增。种子细胞扩增培养的关键问题，在于控制生长条件(如溶氧浓度及pH值)及足量的营养供给(4)。
(二)利用生物反应器培养组织块
人体细胞仿生性地生长在三维支架(载体)中，除了比二维培养大幅增加细胞贴附的表面积外，也增加了生长因子供给效率和细胞外基质(ECM, extra cellular matrix)的合成量，有利于细胞朝多方向迁移、分化和大量增殖(5,6)。
另外，三维多孔结构也有利于氧气和营养物质的传输、代谢产物的排出，以及保持载体内部细胞旺盛的代谢活性(7)。 单层细胞平盘培养之营养来源一般不受限制，这是因为依赖营养液的扩散，足以通过单层细胞10μm左右的厚度，但是当组织块的厚度超过100~200μm时，氧气和营养的扩散就会受到明显限制。实际上患者的组织或器官缺损的体积，往往远超过这个门坎，平盘培养既然无法有效率提供足量的种子细胞，便突显出生物反应器的重要性。它提供的动态培养环境使其内部培养液流动，并使支架内的氧及营养质传更充分，更利于代谢废物排出，并能使细胞分布更均匀，细胞基质分泌更多，细胞表型表达更充分(8,9)。
Freed等(10)利用生物反应器，在直径6.7mm、厚5mm的支架材料上培养出软骨组织块，II型胶原蛋白的含量占总胶原蛋白量的9%以上。Hoerstrup等(11)利用脉动生物反应器培养骨髓间充质干细胞的三尖瓣组织，其结构与机械性能亦接近人体三尖瓣。
■三、组织工程生物反应器的进展
(一)组织工程对生物反应器的要求
动物细胞尺寸在10~30mm之间，比增殖速率较慢(约0.06hr-1)，倍增时间长(约12hr)。以生物反应器培养的细胞密度为106个/mL(约0.3g/L)，较高细胞密度为108个/mL(约30g/L)。细胞的耗氧量较大[约0.3mmol/(L×hr)]，其最大值可达到30mmol/(L×hr)。组织工程生物反应器的培养参数，除了配合前述细胞的特性及需求外，须满足以下的基本要求：生物反应器的设计应方便于培养液的均匀混合，并提供精确的控制，使各营养成分和培养液的pH值梯度尽量减少，此动态培养的方式乃为了使支架(即组织块)内的氧及营养质传更充分，代谢产物更容易排出，细胞表型更充分地表达。培养液混合方式应使剪应力对细胞的损伤降到最低。若为干细胞分化之大量培养，必须注意精准控制干细胞在不同的分化阶段所需不同的生长因子浓度。生物反应器设计要能接近体内发育情况，而体内各种组织和器官所处环境各异，某些种类细胞要求反应器能提供一定的机械应力，如肌腱在体内主要承受张应力，而骨骼主要承担压应力，心血管主要承受脉动式应力，其它可能的物理影响因子尚有磁场、电场等。因此，生物反应器的设计必须能因应不同组织，提供「专一性」的需求。此外，为满足较大体积组织建构对种子细胞数量的需求，常将生物反应器与微载体细胞培养技术结合。由于微载体有较大的比表面积，相同容积的生物反应器比普通培养方式，多出数十倍甚至上百倍的细胞。微载体培养细胞可减少细胞去分化现象，有利于细胞表型的维持，提高种子细胞的质量。因此，生物反应器还需要保持种子细胞与微载体在培养过程中良好的结合。尽管对组织工程反应器有上述苛刻的要求，现阶段使用的反应器，大部分是在既有动物细胞反应器上作少部分的改进，虽然基本上能符合培养需求，但由于专一性不强，甚至存在很多问题，因此生物反应器在组织工程领域还有很大的创新和发展空间。
(二)组织工程的生物反应器种类
(a)搅拌式生物反应器
搅拌式生物反应器(spinner flask bioreactors) 应用于微载体细胞培养，以及软骨和皮肤等组织培养。其主要原理是通过桨式搅拌器来搅动培养液，以增加质传效果，确保培养液的养分和溶氧浓度的均匀分布，达到大规模培养细胞的目的。和其它生物反应器相较，其结构简单、成本较低。组织块培养时，把已完成种植细胞的支架悬吊在瓶塞上，使其浸没在培养液中培养。在接种阶段，细胞藉由流体对流，将细胞运送至支架贴附。在培养过程中，培养液因搅拌的带动，使组织块表面的流体保持交换状态。培养液每隔数天更换一次，以确保营养物质的浓度并移除细胞代谢废物(13)。
搅拌式生物反应器的缺点是搅拌产生的剪应力会对细胞造成不利的影响。为了更加符合组织工程的要求，许多改良产品应运而生，如美国NBS(New Brunswick Scientific)公司的单层篮式通气搅拌器。Kamen等人(14)的带状螺旋桨，分别从通气装置和搅拌器上改进，克服了剪应力过大、易产生气泡等不利细胞的因素。徐小增等(15)在搅拌器罩上一个带夹套的筒体，使培养液流动平稳且规律，并搭配微孔透气供氧系统，避免大气泡的产生。以上因素都是搅拌式生物反应器必须改进的方向。
(b)滚筒式生物反应器(rotating-wall vessels)
滚筒式生物反应器是目前组织工程领域最为广泛应用的生物反应器，一般可应用在心血管、软骨等细胞培养。1990年Kleis等人首先设计使用该型生物反应器，随后美国国家太空总署(NASA)应用到组织工程领域。其主要特点是培养液和组织块在反应器动力带动下，绕水平轴或垂直轴旋转(16,17)，通过气液两相界面进行气体交换，并以无菌注射器换液来补充养分。转动中的反应器对组织块产生了拖曳力(Fd)、离心力(Fc)，以及重力(Fg)等，调节反应器的转速，使旋转产生的离心力刚好和细胞与微载体或支架的重力互相平衡，即可使组织块随反应器旋转悬浮于培养液中，而不致掉落碰壁，故该反应器提供了动态培养的环境、低剪应力和高的质传速率(18~20)。Gao等(21,22)对滚筒式生物反应器系统中的微载体运动进行数值分析，当微载体颗粒的密度大于培养基密度时，颗粒会向筒壁迁移，并撞击壁面。滚筒式生物反应器很少能在线供液，且难以工业规模化，其发展受到限制。如加入灌流，改进在线供液，对其内部环境和成分进行精确控制，是此生物反应器的改良方向。
(c)中空纤维生物反应器
中空纤维生物反应器(hollow-fiber bioreactors)为一特制的圆筒，里面封装着数千根中空纤维，属于一种细微的管状结构，类似于动物的毛细血管，管壁是极薄的半透膜，作为细胞生长贴附及养分传递的界面(23)。当培养液由管束中流过，液体中比孔洞小的养份会穿出中空纤维管束薄膜，供应管外贴附的细胞。细胞代谢产物则会扩散进入纤维管束薄膜内，随培养液流出细胞所在的纤维管束。系统可于37℃培养箱操作，其缺点是细胞种植时会较不均匀，培养液进入端之细胞会较多，同时营养成分也会由培养液进入端至出口端形成递减的梯度。放大产程时，通常使用一个操作台控制很多支中空纤维束，该反应器适合培养高代谢率及对培养环境较敏感的细胞，如肝、肾等细胞。目前此类反应器已作为人工肝临床应用。
Kuk等(24)利用中空纤维生物反应器培养哺乳动物细胞，细胞密度达108~109cells/ml，和其它类型反应器相比增加近50倍。在一般中低细胞密度培养时，对氧浓度要求不高，在反应器中大部分仅藉由膜自由扩散达到质传目的。但在高密度培养时，供氧即不一定足够。Karel(25)、Piret和Cooney等人(26)研究显示，利用中空纤维生物反应器培养高密度哺乳动物细胞时，在离纤维管表面100~200mm处有细胞坏死区。因此，加上脉动流形成对流传递是一种重要的方法。Efthymiou和Shuler(27) 研发的反应器，是利用周期性的方式，使细胞交替与培养基和空气接触，大幅降低气液两相营养的质传限制，此为本反应器目前的发展方向。
(d)灌流生物反应器
灌流生物反应器(perfusion bioreactors)原理为连续添加培养液至培养槽，同时也吸出相同体积的原有培养液，使槽内培养液体积维持一定，养分也能维持在细胞生长所需范围以上，细胞代谢产物则不会堆积太多。培养时将已完成种植细胞的支架悬吊于灌流系统中，培养基直接流过支架之孔隙，流体可在支架的截面均匀分布，让接种的细胞随之均匀注入多孔支架中贴附培养。灌流可以是开放式，由系统中完全清除更换培养液；也可以是密闭系统，经由另一个培养液容器再循环回到原先之培养槽。此外，灌流反应器克服了机械混合产生的剪应力，且因为培养液吸出时不含有细胞，细胞的密度会逐步增加到相当高的密度。若对细胞的周围环境包括pH值、温度、培养液的营养成分、代谢产物等，作精确的监测和控制，培养细胞的密度及质量可以提高(28,29)。此类反应器常用于培养骨骼组织。
(e)施加机械力的反应器(bioreactors with mechanical force)
体内三维组织结构中的细胞在生长时受多种力学刺激，其中应力的作用对组织的结构、形态和功能产生明显的影响(30,31)。关节软骨在体内正常生理状态下承受着间歇性组织液体压力，罗鼣J白多醣的合成有影响(32)。Banes等于1985年设计以真空负压控制牵引力的细胞培养装置。Segurola等(33)用鼠骨骼肌细胞在应力作用下培养，发现中等水平的应力(1~12%)，其诱导细胞排列沿张应力方向；较大的应力(12~24%)，则诱导细胞排列延垂直于张应力方向。施加机械力的反应器，可设计周期性地对组织块施加应力，施力的大小可以控制，如为肌腱或韧带组织设计，可提供张力条件的反应器(34)。
此外，尚可在组织工程生物反应器外加电磁场(electromagnetic field)、脉动、冲击波(shock wave)。电磁场不仅可促进骨的再生和骨细胞的增殖，还可促进成骨细胞分泌IGF-Ⅱ、BMP-2、TGF-β等生长因子和合成细胞外基质(35)。一般使用之电场强度为10~100mA/m2，频率小于1kHz，以提供脉动的反应器建构心脏瓣膜、人工血管等(36)。Wang等(37)用能量密度为0.16mJ/mm2的冲击波(损伤细胞膜而不致损伤细胞器)作用于软骨基质细胞，可使细胞增殖、碱性磷酸酶活性增高、胶原蛋白及骨钙蛋白的合成增加。表一为不同类型生物反应器之性能比较。
■四、生物反应器的组织工程应用
组织工程生物反应器的开发，从取出组织块、分离细胞、扩增到放大培养过程，皆采自动化及个人化量身订作方式。组织工程之医疗愿景如图二(12)，其步骤分述如下：
(a)外科医师取出受诊者的部分组织块，随即引进生物反应器培养；
(b)培养基、营养添加物、立体支架等生物反应器相关用品已预先配置，并储存在良好的温湿度控制室；
(c)细胞在反应器中与组织块分离；
(d)细胞在反应器中扩增；
(e)扩增的细胞与立体支架结合；
(f)持续培养直到新的组织块形成；
(g)培养过程中，生物反应器参数及环境的变量受到严密监测；
(h)配合个别受诊者的临床纪录；
(i)微处理器自动以最适参数调控反应器；
(j)外科医师判读培养组织的监控信息，并决定受诊者最佳的植入时机。
组织工程产品需要大量种子细胞以建构组织块，如何从少量组织藉由生物反应器获取，已成为组织工程研究迫切需要解决的问题之一。目前常使用的贴壁培养或微载体培养，系属二维方式生长，并非人体中的立体形态。组织工程要求三维结构的组织块培养，且不同类的细胞培养后，要能维持其不同的分化与功能。由于培养组织块时，往往无法及时供应其内部细胞足够的营养及适当浓度的细胞因子，且培养过程的代谢产物亦无法迅速排出，导致其生长缓慢甚至死亡。另外，除了甚少的报导外(38)，通常一次仅能针对一种细胞培养，也限制了组织块仿生的程度。目前仅有软骨产品和皮肤移植进入实用阶段，而内脏组织块甚至器官培养，其技术上仍存在上述问题。
各类型生物反应器设计必须能仿生性地接近体内环境，其功能和结构上将更趋复杂，并朝向自动化、多功能化、高效率和多样化发展，期能因应各种组织，精准调控生长因子与激素的释放，稳定控制生物反应器内部温度、pH值及气体分压等参数，又能视需要对培养的组织施加物理参数，如磁场、电场、应力场等。未来，生物反应器在组织工程的应用将对人类提供更多更大的帮助。
反应器种类 剪应力 质传 适用组织种类 可提供的培养方式
搅拌式 大 强 皮肤、软骨 贴壁、悬浮、微载体
滚筒式 很小 弱 心血管、软骨 悬浮、微载体、三维支架材料
中空纤维式 小 中等 胰岛、肝、肾细胞 贴壁、悬浮、微载体、三维支架材料、中空纤维管
灌流式 中等 强 骨骼组织 悬浮、微载体、三维支架材料
施加机械力式 较大 中等 软骨组织 三维支架材料
表一 组织工程生物反应器性能比较
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