(1)准备。将灭菌锅放在2000瓦电炉上，或放在有足够火力的煤气灶、煤炉上，向锅内加水至水位标记线为止。将准备灭菌的培养基及空玻璃器皿用牛皮纸包好，装入锅内套层中，物品放置不宜过多，过挤，锅内应留出三分之一空间。然后盖严锅盖，采用对角式均匀拧紧锅盖上的螺旋，关闭锅盖上的气阀。
(2)加热。点燃热源，开始加热。当锅盖上的压力表达到0.5千克/厘米2时，打开放气阀，排净锅内冷空气，直到压力表回降到“0”时，关闭气阀，继续加热。当压力表上升到所需压力时（一般为1千克/厘米2），开始计算灭菌时间。此时应适当关小热源，不断调节热源大小，使压力始终维持在所需数值上，达到保压时间后，停止加热，使灭菌锅内压力自然下降。
(3)结束。待压力表降至“0”时，拧松螺旋，半开锅盖，用锅内余热烘干盖纸，10分钟后取出灭菌物品。
(4)注意事项。在灭菌过程中，应注意排净锅内冷空气，锅内冷空气如排放不净，会影响灭菌效果，达不到彻底灭菌的目的。由于高压蒸汽灭菌时，要使用温度高达120℃、两个大气压的过热蒸汽，操作时，必须严格按照操作规程操作，否则容易发生意外事故。
