治疗老年性痴呆中药的药效学研究评价探讨
http://www.cde.org.cn 发布时间：2003/12/17 03:35:27 PM
治疗老年性痴呆中药的药效学研究评价探讨
审评一部药理毒理组 黄芳华
进入二十一世纪，全世界正步入全球老龄化时代。老年性痴呆已成为心脑血管疾病和肿瘤之后的第四位疾病，目前，全世界65岁以上人群中老年性痴呆患病率约为5%。而老年性痴呆因其复杂的发病机理，近期在防治上不可能取得突破性进展，故西方有专家预言，老年性痴呆将是21世纪人类第一杀手，目前全球的AD病人估计在2000-2500万左右。老年性痴呆对患者、家庭和社会都带来巨大的压力，使得全世界对其给予众多的关注，抗老年性痴呆的研究成为老年医学领域中的一个重要课题。
目前，老年性痴呆的中药新药申报品种出现，而且有日渐增多的趋势。在这种情况下，探讨中药新药的药效学研究评价成为必需。与大部分其它疾病不同的是，老年性痴呆的发病机理极其复杂，药效学研究评价尚有一定的难度，本文根据现有的研究水平，对药效学评价进行初步的探索。以下仅是个人观点，错误及片面之处在所难免，此文的撰写目的是抛砖引玉，希望更多的相关专家对此问题进行广泛的讨论，以使评价更趋科学、合理。
一、老年性痴呆的概况
阿尔采末病(Alzheimer’s disease,AD)是一种发生于老年期或老年前期的一种慢性进行性的神经变性疾病，以进行性的记忆认知障碍、人格改变为主要特征，AD脑内的主要病理改变为老年斑（senile plaque，SP）、神经原纤维缠结（neurofibrillary tangle,NFT）及大量的神经元丢失，主要发生在前脑基底、海马和大脑皮层。一般称之为老年性痴呆。
从1907年报道第一例老年性痴呆病始，全世界的医学家为这一病症进行了不懈的探索，但直至21世纪的今日，因其病因复杂，目前尚未明确。关于其机理研究，现在主要有以下几种学说，如基因学说、胆碱能学说、传染学说、铝中毒学说、自由基学说、炎症学说、钙超载学说、代谢紊乱学说，虽然各种假说有其合理性的一面，但均存在其局限性，不能全面解释AD复杂、广泛的神经系统病理变化。但能肯定的是：AD的发病与机体衰老密切相关。近年来，对AD与淀粉样蛋白的关系成为研究的热点。
发病机理不明也影响了AD药物的开发。目前，AD的治疗尚无特效药物，其中乙酰胆碱酯酶抑制剂（Acetylcholinesterase inhibitor,AchEI）一直是开发活跃、成果突出的领域。它的开发主要源于胆碱能学说。从20世纪70年代一些科学家发现AD患者的胆碱能神经元功能有不同比例的严重障碍，胆碱能缺陷反应合成Ach的胆碱乙酰化酶（ChAT）的减少，伴AchE表达下降。因而改善胆碱能神经元突触传递，激活突触后神经元功能胆碱酯酶抑制剂减少Ach分解，促进突触传递强度，改善突触后神经元功能，这类药物是目前治疗AD的主要药物，对轻、中度AD具有一定效果。已被FDA认可并在多国上市的他克林、安理申、加兰他敏等均属AchEI类。从中草药千层塔中提取的石杉碱甲是一种生物活性高，对真性胆碱酯酶具有选择性的可逆性胆碱酯酶抑制剂。
二、老年性痴呆相关动物模型
因AD病因复杂，故相应的也缺乏严格意义的AD体内外模型，现在国内外大部分体内、外实验只能反映AD某一部分的改变，因而不应称为AD模型。近年来许多学者正致力于寻找和研究AD动物模型，对AD模型报道也较多，虽然分类各有不同，但大致可分为以下几类[1、2]
（一）胆碱能损伤致痴呆模型
1．穹窿-海马伞切断致痴呆大鼠模型 该模型是建立在AD认知障碍的胆碱能假说基础上，较好地模拟了AD前脑胆碱能系统的损害，而且造成了神经损伤，可用于观察拟胆碱药物的药效学评价，还可观察药物对神经功能损伤的修复作用，是老年性痴呆临床前药效学研究的重要模型。该模型的不足之处是虽然具有学习记忆功能的损害，但并不出现老年斑、神经元纤维缠结和淀粉样蛋白沉积形成等最内典型的组织病理学特征，也无AD病人全身多系统功能衰老的表现。
2．基底前脑注射鹅蒿蕈氨酸（ibotenic acid ,IBO）致痴呆模型大鼠 该模型属兴奋性毒素致基底核损害模型。通过该模型可反映导致学习记忆功能下降的病理基础-基底前脑胆碱能神经元缺失，因而也是广泛应用的模型。该类模型的缺陷是不能反映AD发生的病因，不能产生AD的病理学特征，如老年斑、神经原纤维缠结等，这种兴奋性毒素所产生的损害只能模型AD大脑皮层突触胆碱能缺陷，而这些动物的海马ChAT则不受影响。兴奋性毒素还包括红藻酸钠、N-甲基天门冬氨酸、使君子酸等。红藻氨酸也可诱导产大鼠基底核损害，可使皮层ChAT损失40-50%，并与Ach水平、HAChT和AchE活性的降低相平行，而其他递质系统无明显改变，而且在避暗试验中出现记忆保持障碍，可作为潜在的动物模型，但红藻酸钠是一种强效的惊厥药，能产生损害，因此不如IBO应用广泛。
3．东莨菪碱致胆碱能损伤拟痴呆小鼠 东莨菪碱为M胆碱能受体阻断剂，可阻断乙酰胆碱对M受体的激动作用，造成了学习记忆功能障碍。但是该模型不直接引起胆碱能神经缺失，而且缺乏研究AD病理生理所必需的特征，如AD是一种进行性不可逆变性，而该模型为化学性模型，恢复快是其局限性，可用于早期药物的筛选。
（二）老化致痴呆模型
1．自然衰老动物 较常用的是自然衰老大鼠，24月龄以上，另外也有采用老年狗或猴者，该模型是较为接近AD实际病理改变的动物模型，在此基础上观察老年性痴呆治疗药物能较好地反映药物的作用机理和效果。但是其不足之处有：（1）由于AD是一种不同于正常衰老的进行性神经功能衰退性疾病，故老年动物有其局限性，它只是部分模拟了与人正常衰老相关的神经生化改变，而不能全面模拟AD的变化。（2）有实验材料较难得、需长时间饲养、死亡率高，实验周期长等缺点，大大限制了该模型的应用。（3）老年动物的健康状况的差异，以及在药物吸收、代谢和分布上的变异性，有时会产生统计学意义不确定的结果。
2．快速老化小鼠（SAM） 快速老化小鼠分为快速老化亚系（senescence accelerated mouse/prone,SAM-P）及抗快速老化亚系（senescence accelerated mouse/resistance,SAM-R），它是由日本京都大学首次培育成功，经20多代交配近繁，获得了遗传性与病理表型一致，符合近交系标准的新系列。SAM-P品系中，有两个亚品系P8和P10除具有P品系的一般老化症状外，还伴随着快速老化出现的学习记忆力障碍和低恐怖低紧张状态，为脑老化痴呆模型小鼠。两亚系的共同点是均具有认知障碍，且在渡过生长期后，伴快速老化自然发生，与临床痴呆的渐进性发生极为相似，它们还各具特点，如P8脑中出现明显的A鈣沉积、PAS染色阳性颗粒状结构和海绵样变性，P10则伴有广泛性脑萎缩。大量研究表明，P8和P10是比较理想的研究脑老化和痴呆的模型，与其同源对照R1相比，其行为学、形态学、神经生化、多种酶类以及组织蛋白和基因表达均出现异常[3]。SAM-P小鼠为探讨衰老及衰老相关疾病的发生，评价药效及其作用机制提供了良好的动物模型，其中SAM-P8较多用。但是该模型来源比较困难。
3．D-半乳糖皮下注射致脑老化小鼠模型 该模型在国内广泛应用于抗衰老的研究。它可模拟AD的氧化损伤，还发现小鼠学习记忆下降、脑内胆碱能系统功能衰退、神经递质代谢异常、皮层和海马神经元损伤、超微结构和突触可塑性发生衰老性改变等与AD类似的改变等。但是它对AD缺乏针对性，而且国外几乎很少使用该模型。
（三）A鈣致痴呆模型
1．APP转基因小鼠 该模型是以根据分子遗传学和胚胎学理论和技术，利用显微注射的方法将APP基因或基因片段整合入小鼠的基因组中，使得小鼠脑部表达人APP基因，通过APP蛋白在大脑中累积，产生老年斑，从而造成小鼠老年性痴呆转基因模型。该模型为研究APP代谢、AD的发生和发展及药物干预对发病进程的影响提供了模型，同时现在该模型已能够复制出类似AD病人脑内的部分病理变化，同时有学习记忆功能的障碍。该模型是国际承认的主要AD动物模型。但是该模型大部分只是移植了一到两个APP基因，与真正的一组基因控制的动物模型还有一定的差距，而且该模型动物价格较昂贵。
2．A鈣注射致痴呆模型 该模型是利用A鈣是AD患者脑中老年斑的核心蛋白，AD发病与脑内炎症改变而制作。故将A鈣肽段注入动物海马区，可较好地反映AD的特征性改变A鈣在AD发病中的作用，该模型可用于研究治疗AD药物在A鈣聚积或沉积、神经毒性作用和小胶质细胞的炎性反应等方面作用，是临床前药效学评价的重要模型。目前一般推荐使用A鈣1-40肽段大鼠海马内注射模型，也有用A鈣25-35海马注射者。另外还有A鈣脑室注射致痴呆模型，该模型利用了A鈣直接注入脑室，经侧脑室弥漫至全脑，更接近于A鈣引起细胞毒作用的实际过程。
（四）慢性脑缺血致痴呆模型
近年来血管因素在AD发病中的作用越来越引起人们的重视。脑供血不足可导致脑损伤和一系列的临床症状，，因而脑缺血模型也逐渐用于老年性痴呆药物的研究。有研究发现大鼠双侧颈总动脉结扎致脑缺血模型可引起行为缺失和脑组织病理生理改变，在许多方面与痴呆（包括AD）相类似；也有用结扎16月龄大鼠双侧颈总动脉同时烧灼一侧椎动脉造成脑长期供血不足者。有报道称有脑血管病的患者AD发病率高于正常人，而且临床上有不少AD患者同时合并血管性痴呆和脑供血不足等情况。故脑缺血模型可作为AD模型的补充，更适合于混合型痴呆的药物作用观察。
（五）其它模型
1．铝模型 铝诱导痴呆模型是以AD的铝中毒假说为基础的。据报道，AD患者脑组织内铝含量较正常人高，其原因可能是病人血液中转铁蛋白有缺陷，无法将血液中的铝适当清除，多余的铝进入大脑后参与形成神经纤维缠结和老年斑，损伤神经元。铝剂注入动物脑内可出现学习记忆功能减退，如家兔脑内注射铝、小鼠三氯化铝注射等，也有采用口服枸椽酸铝使动物发生学习记忆障碍和AD样病理改变，造成拟痴呆模型。但该模型所形成的神经纤维缠结没有PHF或磷酸化的tau蛋白，且中枢胆碱能活性正常，因而用铝是否能造成AD模型尚有需进一步研究。
2．线粒体缺陷致痴呆模型 有报道AD与脑内线粒体氧化磷酸化异常有关。叠氮钠（NaN3）是线粒体呼吸链复合物IV的特异性抑制剂，有报道应用微泵长期、缓慢、恒速地给予叠氮钠，模拟老年性痴呆长时程、进行性恶化的发病特点，可导致脑内细胞色素C氧化酶（即线粒体呼吸链复合体IV）活性下降并引发学习记忆障碍。
3．蛋白磷酸化酶抑制剂慢性损害致痴呆模型 神经原纤维缠结是AD脑内病理改变之一，过度磷酸化的tau蛋白是AD患者神经元NFT的主要成分，该模型利用蛋白磷酸酶的特异性抑制剂Okadic acid可引起培养的神经细胞tau蛋白磷酸化水平增高、细胞骨架损伤、细胞形态改变以及存活率下降。该模型主要用于针对tau蛋白药物的药效观察。该模型造价昂贵。
4．自然免疫痴呆模型 该模型是基于AD的自身免疫学说，因而许多实验室采用多种自然免疫动物模型来研究AD的发病机制，并开始用于AD药物筛选。如Sakic等建立了MRL-1pr小鼠模型，并将MRL、NZB、BXSB品系小鼠杂交，建议了一种系统红斑狼疮样的自身免疫小鼠模型，发现有学习记忆功能衰退。目前，这类模型的研究正成为新的热点。
5．灵长类动物 值得注意的是，现有亦有研究用灵长类实验动物进行AD研究的。恒河猴与AD相关的病变包括认知功能障碍、神经元丢失和变性、老年斑和血管淀粉样蛋白沉积等，其中病理表现是确诊AD的重要依据。除恒河猴外，包括食蟹猴、狒狒、松鼠猴、黑猩猩和狐猴等也观察到了脑实质的淀粉样蛋白沉积[4]。另外，人工诱发恒河猴AD样病理的方法包括化学物质损伤、金属中毒、转基因、手术损伤和自身免疫方法损伤等，如损伤胆碱能神经系统模型、鈣淀粉样肽损伤模型。因恒河猴模型较啮齿类模型更好地模拟了AD的病理变化，但目前模型制作尚不够完善，有待于进一步突破。而且也应注意到与人类的差别，以及不同灵长类动物之间的种属差异，而从行为学、病理学和遗传学的研究方面进行深入研究。
6．记忆障碍模型 目前在痴呆药物中常用到各种记忆障碍模型，如M胆碱受体阻滞药东莨菪碱（前文已有叙述）或樟柳碱造成的记忆学习障碍模型、脑蛋白质合成抑制剂环乙酰亚胺或致脑缺氧剂如亚硝酸钠造成的记忆巩固障碍模型、中枢抑制剂如乙醇如记忆再现障碍模型，以上模型均可用于对学习记忆作用的筛选，但不应称之为AD模型。
7．体外筛选模型 目前有利用体外模型进行老年性痴呆药物的初筛，如将M胆碱能受体应用放射性免疫方法建立抗早老性痴呆药的Ｍ1受体筛选模型[5]，该模型在人胚肾细胞上表达人源M1受体,通过检测胞内cAMP来监测受体的激动情况。使用外源性的3HcAMP竞争胞内的cAMP结合位点。使用氯化乙酰胆碱作为阳性药来确证模型的可靠性，结果显示该模型对M1受体激动剂有阳性反应,可用于抗早老性痴呆药物的筛选。老年性痴呆的基因芯片正在研究中，如采用SAM鼠筛选到的差异表达基因，根据其制成芯片，可为研究AD发病机制、临床诊断、治疗打下基础，同时也为药物筛选取提供手段[6]。但这些快速筛选方法仍有待于进一步深入研究，而且经过这些体外初筛的受试物尚需通过一系列的体内、外试验来确证其药效作用。
目前在研究的还有多种模型，在此不一一列举。
三、药效学研究中值得注意的几个问题
1．模型及观察指标的选择
上述这些模型，从不同方面来模拟AD，但都只是模拟AD的某些方面的特征，尚无一个理想的模型来模拟AD全面的变化。作为药效学评价，应根据药物特点选择相应的动物模型。以上列举的模型各有其优缺点和针对性，如胆碱能损伤模型可用于胆碱能药物作用的评价，A鈣致痴呆模型可重点用于观察药物对A鈣的作用等。因胆碱能功能缺损在AD病因中是目前较为公认的，因而可在评价药效时采用胆碱能损伤致痴呆模型；A鈣沉积及毒性作用在AD发病中非常重要，因而评价时可考虑A鈣致痴呆模型；而老化是AD最大的危险因素，故老化致痴呆模型在药效学评价中亦很重要。
观察指标的选择亦应根据药物各自的特点、模型的不同机理而进行。如可进行行为学检查、相关生化检查、病理检查等，其中生化检测可包括以下胆碱能相关指标（如ChAT、AchE、脑胆碱能受体密度及亲和力、乙酰胆碱含量等）、NGF、自由基相关指标、相关蛋白、相关基因、炎性因子等，病理检查可包括A鈣沉积、老年斑、神经纤维缠结、神经元形态、数目、小胶质细胞、星形胶质细胞、营养因子等等。总而言之，无论是模型还是指标的选择，作为新药开发应充分发挥研究者的主动性，根据药物各自的特点进行研究，尤其是对于老年性痴呆这一病因尚未清楚的病种。
值得一提的是，目前有些研究中仅进行了化学物质造成记忆损害模型进行学习记忆功能的测定，有些即便采用了较为简单的AD相关模型但也只检测了学习记忆功能和简单几个生化指标（如自由基指标），而未采用较为典型的AD相关模型，未对AD的多方面指标进行综合观察。在这种情况下，我们难以从单纯的行为学试验来评价受试物对AD的有效性，因此需要针对AD补充进行一系列的研究。
2．阳性药的选择
作为药效学试验应设阳性药对照组，阳性药应采用已批准上市的药物，确有疗效，可选用中药和化学药。阳性药应根据相应的模型和观察的指标来选择，并不要求所有的药效学试验均采用同一个阳性对照药。有些申报资料中全部试验均选用一种阳性药，结果在一部分试验上阳性药未表现出明显的作用。由于设阳性药的目的除可将受试药与其进行比较外，最重要的目的是验证方法学的可靠性，因此合理选择阳性药十分关键。如某一品种共进行了5个试验，其中3个试验中采用了一种中药为阳性对照组，而在这三个试验中均未表现出明显的作用，而另1试验中采用了另一种药物作阳性对照，同样亦未表现出作用，在这种的试验情况下阳性对照组的设置就失去了意义。阳性药应根据药物可能的机理来合理选择，如果初步研究提示某受试物可能通过增强胆碱能作用来达到治疗AD的作用，那么在胆碱能模型或测定胆碱功能时则可用胆碱酯酶抑制剂作为阳性对照。
3．对模型与观察指标的综合评价
试验结束后，应对所有的试验资料进行综合分析讨论。现在有些申报资料的主要药效学部分仅将所有的试验列举，而不对结果进行分析。作为审评人员，由于受到专业的限制，及对试验过程的不了解，较难从未经分析的试验结果中推测出试验的真正意义。因此，申报资料应该全面阐述进行该项试验的目的意义，对试验方法和结果进行分析讨论，并阐述本项试验对于说明受试药物可用于AD的意义。以上虽指的是老年性痴呆药效学研究中应注意的几个问题，但在其它的药效学评价中亦应注意这些问题。
四、结语
以上介绍了一些可用于AD药效评价的模型，研制单位可根据所研究药物的性质和研究目的加以选择。如老年性痴呆的药物中的胆碱酯酶抑制剂，其主要重点在抗胆碱酯酶，而非其它点，当然不一定非得进行其他方面如炎症模型等方面的试验（当然其前提条件是在已通过前期研究发现其重点在于抗胆碱酶）。若能在所有的模型上对各种指标均能作出阳性结果，倒有结果不可靠之嫌疑。应该指出，新药开发是一种研究行为，研究者应跟踪最新研究进展，创造性地进行研究工作。不应期望有一个完善的指导原则，根据要求“做作业”。随着对疾病认识日益深入，试验手段也有不断
