中药、天然药物非临床药代动力学研究专题讨论会会议纪要
http://www.cde.org.cn 发布时间：2003/11/13 10:40:33 AM
中药、天然药物非临床药代动力学研究专题讨论会
会议纪要
审评一部 药理毒理组
会议时间：2003年7月31日
会议地点：中国科技会堂
参加人员：药代动力学专家、药审中心技术人员
新的药品注册管理办法要求中药、天然药物注册分类第一类新药需进行药代动力学研究，但因以往并无比较明确的“技术要求”，故可能是造成药代动力学申报资料中存在诸多问题的原因。随着中药、天然药物有效成分新药申报品种的逐年增多，以及审评的需要，及早提出相关的技术要点和基本要求显得更加迫切和重要。为了推动中药药代动力学的研究，提高中药新药的研究水平，客观公正地进行技术审评，药审中心审评一部组织召开了此次专题讨论会，以期能结合我国中药、天然药物的研究现状，对非临床中药新药药代动力学研究的基本要求等提出初步的意见和建议，也希望能以此与申报者进行交流和探讨，最终达到加快中药新药开发速度、加强和提高中药新药研究水平的目的。
本次专题讨论会除讨论和制定了中药、天然药物非临床药代动力学研究的技术要点和基本要求外（见附件），还重点对以下问题进行了关注。（1）关于研究的重要性和意义。分析了目前申报品种出现诸多技术及试验设计方面问题的原因，认为必须首先明确临床前药代动力学研究的目的和意义。希望通过比较完善深入的基础研究建立起符合要求的生物样品分析方法，并着重关注药物的体内分布等。非临床药代是为临床药代服务的，其最终目的是为临床有效性和安全性研究服务的。由于生物样品分析方法直接在人体建立，既会造成经济上的浪费，也不符合伦理学要求，药物在体内的分布更不能在人体进行。所以，在根据中药有效成分的特点建立起合适的生物样品分析方法和药物在动物体内的分布是非临床药代动力学研究的最主要目的。（2）关于质量控制。一般试验者多忽略或不重视该部分研究内容，实际上它是方法学评价中的重点内容之一，该部分不完善或不符合要求也直接影响到样品测试结果的评价。建议在生物样品分析方法确证完成之后再开始测试未知样品。每个未知样品一般测定一次，必要时应复测。生物样品每天测定时应建立新的标准曲线，并随行测定高、中、低3个浓度的质控样品。质控样品测定结果的偏差一般应<15%，低浓度点偏差一般应<20%。若不合格，则当天的测试结果作废。（3）关于代谢。中药药代动力学是否需要进行代谢研究一直是有争议的部分。有专家认为应对代谢（生物转化）研究提出相应要求，其限定条件是当原形药在尿、粪中排出量低于给药剂量的50%时（因这时生物转化可能是体内重要的消除途径）；或当药效学试验缺乏明显的剂量-效应关系时，均应进行药物的代谢研究，至少应探明代谢的途径，以及代谢物与原形药物的相对量等。（4）关于多次给药的研究。在附件中的基本要求中仅提出进行单次给药的药代研究，而未要求多次给药研究。但讨论认为，当长期毒性试验结果显示出药物有明显蓄积毒性时，应考虑进行多次给药的药代动力学研究。（5）关于生物利用度：专家一致认为非注射途径给药的新药应进行生物利用度的研究，因为这是衡量一个新药质量的重要因素。但当药物固有的理化性质难以进行静脉注射时，应当对不进行生物利用度测定的原因做出详细说明。也有专家认为，对于难溶性药物，可考虑使用二甲基亚砜等有机溶剂。（6）关于试验结果。因试验结果直接影响到对受试物在动物体内的动态变化规律及药代特征的评价，是决定药代研究是否符合要求的关键。为合理、客观、公正地对试验结果进行评价，建议申报资料应详细描述所用的分析方法，引用已有的参考文献，并提供每天的标准曲线、质控样品及未知样品的结果计算过程，提供全部未知样品分析的色谱图，包括全部相关的标准曲线和质控样品的色谱图等。
本次会议纪要只是介绍一些原则性的基本要求，药品审评中心不推荐申请人将本文的要求套用于每个中药、天然药物有效成分的新药的研究中，建议在进行具体的研究工作时，应遵循“具体问题具体分析”的原则。只要所获得的试验结果能最大限度地为合理制订临床试验方案提供充分可靠的试验依据，采用任何试验方法都是可以接受的。
附件
中药、天然药物非临床药代动力学研究的
技术要点和基本内容
中药、天然药物非临床药物代谢动力学研究的目的，在于揭示中药、天然药物新药的有效成分在动物体内的动态变化规律，阐明其吸收、分布、代谢和消除的过程和特点，并根据数学模型提供重要的药物代谢动力学参数，为临床试验设计合理的给药方案提供试验依据。
非临床药代动力学的研究，对于预测受试物可能的不良反应和药物相互作用具有重要的意义。
鉴于中药、天然药物自身的特点，其纯度可能低于化学合成的药品，化学结构往往较化学合成药复杂，分解产物难以推测，理化性质（如分子极性、解离度、脂溶性等）也不十分清楚。因此在中药、天然药物的非临床药代动力学研究中应注意这些特点带来的一些不同于化学药品非临床药代动力学研究的一些特殊性。
一、药代动力学研究的技术要点
1. 受试物
在进行中药、天然药物的动物药代动力学研究以前，新药的开发研制单位应尽可能通过购买、合成、提取、纯化等方式获得该药物主要成分的对照品。
受试物应为中试放大产品，样品质量应稳定。
受试物经同位素标记进行药代动力学研究时，同位素的种类、标记的位置、纯度等应明确。
2. 试验系统
根据药效学与安全性试验结果，选择适当的实验动物及体外试验系统。受试动物必须采用成年、健康动物。常用实验动物为大鼠、小鼠、兔、豚鼠、犬、猴等。所选动物与性别尽量与药效学或安全性研究所用动物一致。口服给药时，不宜选用兔和反刍动物如羊等。受试动物在试验日前三至七日应在试验场所进行适应性饲养。
3．给药途径
给药途径原则上应选择拟临床用途径（如有特殊情况，要加以说明），尽量在清醒状态下给药。
4．给药量
一般根据药效学、安全性试验结果及拟临床用量来设计给药剂量。对于不能达到检测灵敏度的情况，可采用能检测的高剂量进行试验。
5．给药周期及给药频率
一般采用单次给药。
6．生物样品的定量分析方法
通常选用色谱法，如HPLC、GC以及LC-MS、GC-MS、LC-MS/MS和GC-MS/MS联用技术，一般应采用内标法定量。必要时也可采用生物学方法或生物化学方法。
在有些中药、天然药物新药的研究中，有条件制备放射性核素标记的药物，采用放射性核素示踪的方法进行该药物在动物中的吸收、分布、代谢和排泄的研究。在这种情况下，也可以利用现成的放射性核素标记药物进行动物的药代动力学研究。
用放射性核素标记研究药物时，需要考虑示踪原子和标记部位(单标记，多标记)的选择、标记物的稳定性和标记率等多种因素。用放射性核素标记药物，在用前要进行纯度检查，放化纯度要>95%。定位标记要指明标记位置。尽量不用以曝射法制备的非定位3H标记物。如用非定位标记，其测定结果除提供放射活性外，还应提供色谱分离后能代表原型药物和活性代谢物的测定结果。
由于生物样品中总放射性的测定不能区分原药及其代谢产物，因而并不能完全反映药物的代谢情况。因此在进行血药或尿药浓度的测定时，要注意测定的特异性，必要时可配合采用薄层层析或采用放射性色谱法。
生物样品分析方法的确证应包括以下内容：
（1） 灵敏度：用最低检测浓度或定量限（Limit of quantitation, LOQ）来表
示。一般以ng/ml(g/L)或g/ml(mg/L)表示。要求能测出3~5个消除半衰期后血药浓度或能检测出Cmax的1/10~1/20的血药浓度。
（2）特异性：必须能证明所测的化合物为目标化合物，并能排除不同生物基质（如血、尿、粪、胆汁及组织匀浆）的内源性物质和杂质的干扰。
（3）精密度：用日内及日间变异系数（RSD=（SD/均值）×100%）表示。要求在标准曲线范围内选择低（接近LOQ），中和高（接近上限）三种浓度，每一浓度重复测定5次，求出各自的RSD（%）。接近LOQ时RSD<20%，其余浓度时RSD则应<15%。
（4）准确度：是指用特定方法测得的生物样品浓度与真实浓度的接近程度，可用相对回收率表示，一般应在85~115%范围内，在LOQ附近应在80~120%范围内。应在标准曲线范围内选择低、中、高三个浓度，每一浓度重复5次。
（5）标准曲线：不同生物样品（如血、尿、粪、胆汁及组织匀浆）应制备各自的标准曲线，标准曲线应至少由不包括空白的5个浓度组成，并应覆盖整个生物样品的浓度范围，不得外推求算未知样品的浓度。相关系数要求：色谱法应>0.99，和生物法>0.98。
（6）样品稳定性：对保存在冷冻，室温条件下以及冻结一融化过程中的样品应进行稳定性考察。
（7）方法学质控：应在生物样品分析方法确证完成之后，开始测试未知样品。每个未知样品一般测定一次，必要时可进行复测。生物样品每天测定时应建立新的标准曲线，并随行测定高、中、低3个浓度的质控样品，每个浓度双样本。质控样品测定结果的偏差一般应<15%，低浓度点偏差一般应<20%。如不合格，则该天测试结果作废。
建议在新药注册申请时提供以下研究数据：
（1） 采用色谱分析法，应提供包括有标准品，空白样品，外加样品及用药后生物样品的色谱图。采用放射性核素法时，应提供测定特异性的相应证据。
（2） 标准曲线图，其回归相关分析方程及相关系数。
（3） 日间和日内精密度和回收率数据，及最低检测浓度（定量限）。
（4） 样品的稳定性考核数据。
（5） 未知浓度样品质控检查的测定数据。
放射性核素标记药物在用前要经过纯度检查，放化纯度要大于95％。放射免疫法和酶标免疫法具有一定特异性，灵敏度高，但原药与其代谢产物或内源性物质常有交叉反应，需提供证据，说明其特异性。生物检定法常能反映药效学本质，一般特异性较差，最好用特异性高的方法对比、证明，否则要加以说明。
二、药代动力学研究的内容
（一）药物动力学参数测定
1．啮齿类动物的药代动力学研究
通常在小动物中进行三个剂量的药代动力学研究，一般情况下，可只选择一种性别的动物。必要时，应进行两种性别的动物进行试验，并在研究中注意研究性别之间的差异。
受试动物数：最好从同一动物多次取样，尽量避免用多只动物合并样本。多只动物合并样品应相应增加动物数。以药时曲线的每个时间点应有3~5个数据计算所需动物数目。
药物剂量：一般选用低、中、高三种剂量。剂量的确定主要根据药效学的试验结果。
受试动物在给药前禁食12小时。如需收集尿样，则在给药后将动物放入代谢笼。按试验方案在服药前、后不同时间采取血样和尿样（尿样在记录总体后，留取所需量），如当日不进行测定分析，样品均应储存在-20℃冰箱中待测。
采样点的确定：采样点的确定对药代动力学研究结果具有重大的影响。服药前采血作为空白样品，用药后的一个完整的血药浓度-时间曲线，应包括药物的吸收相、平衡相和消除相。一般在吸收相和平衡相各应采取2~3个取样点，而消除相则应有3~5个取样点，至少应为3~5个消除半衰期的时间，或采样持续到血药浓度为Cmax的1/10~1/20。如果同时采取尿样时，则应采取服药前尿样，并参考预试验的资料，设计服药后收集尿样的时间点，包括药物从尿中开始排泄，排泄高峰及排泄基本结束的全过程。为保证最佳的采样点，建议在正式试验前，选择2~3个动物进行预试验工作，然后根据预试验的结果，审核并修正原设计的采样点。
药代动力学参数的估算：将试验中测得的各受试动物的血药浓度-时间的数据分别进行药代动力学参数的估算，求得新药的主要药代动力学参数，其中口服给药包括：Ka（吸收速率常数）、Tmax（峰时间）、Cmax（峰浓度）、AUC（血药浓度-时间曲线下面积）、Vd（表观分布容积）、Kel（消除速率常数）、t1/2（消除半衰期）、CL（清除率）等。静脉注射包括：t1/2(a)、t1/2(b)、K12、K21、K10、Vd、CL(T)、AUC等。一般可用模型法求算，如无合适模型选择时，宜按非房室模型分析。尿药排泄动力学参数可用总和减量法（亏量法）等方法估算其消除半衰期（t1/2）和排泄速率常数（K）。如用电子计算机程序处理数据应指明所用程序的名称和版本。
2．非啮齿类动物的药代动力学研究
剂量可选择拟在临床上使用的常用剂量的换算剂量，可以采用一种剂量，也可以根据将来临床上使用的要求采用多种剂量。受试动物数量以药时曲线的每个时间点有不少于3个数据为限进行计算。在研究中应注意研究性别之间的差异。在试验设计方面可参考“啮齿类动物的药代动力学研究”一节中对采样点和药代动力学参数的估算的要求。
3．建议在新药注册申请时提供以下研究数据：
（1）各个（或各组）受试动物的血药浓度-时间数据及曲线图和其平均数据及曲线图。
（2）提供各个（或各组）受试动物的主要药代动力学参数和其平均值与标准差。
（3）对新药单剂量给药非临床药代动力学的规律和特点进行简单扼要的讨论和小结。
（二）生物利用度的研究
生物利用度是判断药品所采用制剂及给药途径合理性的重要因素，非静脉给药应分别采用口服和静脉给予受试物的方法，采用适宜的动物进行该制剂生物利用度的研究。当受试物难以进行静脉给药而不能测定生物利用度时，应详细说明理由。
（三）药物的分布
选用大鼠或小鼠做分布试验较为方便。选择一个剂量（一般以治疗剂量为宜）给药后，主要测定药物在心、肝、脾、肺、肾、血浆、胃肠道、生殖腺、脑、体脂、骨骼肌等组织的分布。特别注意药物在靶器官（包括药效学与毒理学）的分布。以药-时曲线作参考，选2-3个时间点分别代表分布相（或吸收相）、平衡相和消除相的药物分布（消除相的组织分布必须包括在内）。每个时间点的组织，必须有至少5只动物的数据。
做分布实验，必须注意取样的代表性，如取1/2或1/4个肾脏应注意对称取样。
（四）药物的代谢
在粪、尿排泄试验中，当原型物累计排出量低于给药剂量50%时，应进行代谢产物的初步研究，从尿、粪或其他生物样品中发现可能的代谢产物，以初步简明其代谢转化形式。有可能时，应进行代谢酶的诱导或抑制试验。
（五）药物的排泄
1．尿粪排泄：进行尿和粪的药物排泄试验，要将动物放入代谢笼内，给药后不同时间间隔分段收集尿或粪全部样品。记录尿体积，混匀，取一部分样品，测定药物浓度。粪样品可先称重，后研磨均匀制成匀浆，取出一部分进行药物含量测定。取样直至药物已排尽（不能检出）为止。
2．胆汁排泄：一般用大鼠在乙醚麻醉下作胆管插管引流；待动物清醒后，以各种途径给药，并以合适的时间间隔分段收集胆汁，进行药物测定。
取样结束后，须计算药物自粪、尿、胆汁排出的速度及总排出量。
（六）药物与血浆蛋白的结合
研究药物与血浆蛋白结合的方法很多，如平衡透析法、超过滤法、分配平衡法、凝胶过滤法、光谱法等，其中以平衡透析法最简单、经济，但较费时，一般约需24h方达平衡，最好置冷室进行，以免药物或蛋白质破坏。其它方法各有优缺点，根据所研究药物的理化性质及实验室条件，均可选择使用。
1．如按各种透析法进行实验，应按下式计算药物与血浆蛋白结合的百分数。
滤出液（游离型）浓度
结合百分数=（1- ）×100
袋内（总）浓度
2．注意事项
（1）药物与血浆蛋白结合程度受很多因素影响，如血浆pH、血浆浓度、药物浓度等。血浆pH应固定为7.4，至少选择三个血药浓度（包括有效浓度在内）进行实验。
（2）必须证明药物与半透膜本身无结合，应做对照予以校正。如结合严重，必须改用其它方法。
（3）有时从半透膜上溶解下来的成分会影响药物测定，应特别注意。要分析引起空白读数高的原因，设法除去。
（4）可被血浆转化的药物，要加少量酶抑制剂，如氟化钠等，以终止其转化。
三、小结
试验前，研究者应明确其进行药代动力学的目的，明确通过药代动力学试验需解决的问题。在总结讨论的内容中，应针对试验目的，结合试验内容和试验结果加以讨论，特别应说明其试验结果是否达到了预期目的、解决了预期问题。
2002．8．29
