新型冠状病毒核酸扩增（PCR）荧光检测试剂盒说明书内容介绍
生物制品及体外诊断试剂组 张丽
目前已确认急性传染性非典型性肺炎（SARS）的致病原为新型冠状病毒，对新型冠状病毒感染的检测主要集中在以下两个方面：（1）分子生物学检测。（2）抗体检测。2003年3月27日香港科学家设计出第1个可以用于新型冠状病毒核酸检测的PCR试剂盒，2003年4月3日WHO公布了7对引物用于新型冠状病毒的RT-PCR检测，欧盟于2003/8/22批准德国HAMBURG. Abbott Laboratories and GmbH合作的产品RealArtTM HPA Coronavirus LC RT Reagengs进入市场使用（CE marked）。目前我国已有抗体测定、病毒核酸测定试剂盒批准试生产。与以往诊断试剂的说明书相比，新型冠状病毒核酸检测试剂盒的说明书中增加了对实验结果的解释、检测方法的局限性，并附该产品的临床考核结果，其目的是避免对试验结果的误解。本文对已批准试生产的新型冠状病毒核酸测定试剂盒说明书中较重要内容及撰写目的作一详细介绍，并附该部分内容的样稿（附件），以便于关注者获取更多的信息，并帮助使用者和临床医生准确的理解其实验结果。
一.关于方法 原理
已批准试生产的产品及RealArt TM HPA Coronavirus LC RT Reagengs均采用核酸扩增荧光检测的方法：首先从样本中提取病毒RNA，利用逆转录酶将RNA逆转录为cDNA，在核酸扩增开始时加入荧光标记探针，探针的5，端标记荧光报告基团（FAM），3，端标记荧光淬灭基团（TAMRA），当探针完整时，报告基团与淬灭基团非常接近，报告基团荧光被淬灭基团抑制。在PCR过程中，如果靶序列存在，荧光标记探针可特异性地结合到靶序列上。在PCR扩增过程中，由于Taq DNA聚合酶的5，端核酸外切酶活性，使已经退火并结合到模板上的荧光双标记探针被酶解，解除TAMRA对FAM的淬灭。从而使报告基团表现荧光的活性，在480nm的激发光下产生520 nm的荧光。PCR扩增后，进行荧光强度的测定。
虽然上述产品均采用了核酸扩增荧光检测的方法，但不同企业产品之间仍存在许多不同之处，如扩增片段所处基因组的具体位置不同，扩增片段的长度不同。每个产品能够测定的样本类型不同如血液样本、漱口液样本、粪便样本。针对不同类型的样本，病毒核酸的提取方法不同。不同产品分别采用了逆转录和核酸扩增同时进行的一步法或逆转录和核酸扩增分开进行的两步法。
二.关于临床使用目的
鉴于目前有关新型冠状病毒的基础研究仍比较薄弱，该检测方法存在许多局限性，我们参考WHO、美国CDC、我国CDC等有关文献，将新型冠状病毒核酸检测的临床使用目的定位于：可试用于新型病毒感染的辅助诊断，检测结果仅供临床参考，不能单独作为确诊或排除病例的依据。
三.关于对试验结果的解释
为避免对试验结果的误解，参考了WHO、美国CDC、我国CDC等有关文献，以及上述产品完成的临床考核结论，在说明书中详述了对试验结果的解释，其目的是再次强调一个测定结果不能单独作为确诊或排除病例的依据，最终诊断必须密切结合临床指征及其它实验室检测结果综合考虑。
四.检测方法的局限性
1.检测方法设计的局限性
该类试剂的特异性主要由引物和探针决定，还与选择严谨的反应条件有关。通过与其它已知冠状病毒的序列进行同源性比较 ，选择引物和探针。已批准产品扩增引物和探针都是依据新型冠状病毒pol区加以选择、设计的，研发人员在设计过程中参考了WHO网站公布的信息。WHO网站公布7对引物的同时说明：采用该7对引物进行病毒核酸测定的敏感度和特异性尚有待进一步研究、确证。由于对新型冠状病毒认识有限，并且因疫情的特殊性，产品研发在相对较短的时间内完成，对反应条件进行的优化工作有限，所以在方法设计方面有不可避免的局限性。
2.临床考核的局限性
研究、评价诊断试剂的临床诊断价值，最基本的方法是确定“金标准”，选择研究对象、进行盲法比较。对于SARS而言，从患者体内或标本中分离到SARS-CoV是唯一可以令人信服的“金标准”，但由于试验条件等的限制，对患者标本进行病毒的分离和培养是不可能的。又由于临床样本资源的问题，临床研究受到很多方面的限制。研发单位按照国家食品药品监督管理局发布的《SARS诊断试剂生产研制技术要求》（SFDA网站发布）完成了临床考核。鉴于SARS的特殊性，临床考核试验尚不完善，所以临床考核结论有其局限性。
综合目前对病原体的认识、检测方法的设计和临床考核的局限性，在说明书中增加了检测方法局限性项目，其目的是帮助使用者和临床医生准确的理解该检测方法的实验结果。
五.临床考核结果
产品说明书中罗列了研发单位的临床考核情况，包括临床考核单位和详细的考核结果，其目的是便于使用者获取更多的信息。需要说明的是，研发单位按《SARS诊断试剂生产研制技术要求》完成了临床考核，其样本数特别是各不同时间段的样本数有限。另外考核结论是以临床诊断为标准，但临床诊断标准中有很多不确定和可变的因素，而且还存在误诊和临床资料不完整等实际情况。
已完成的临床考核结果显示：在发病初期如10天内，对临床确诊SARS患者血清样本和粪便样本的阳性检出率约为50-60%，对漱口液样本的阳性检出率约为70%左右。在发病晚期如20-30天，对临床确诊SARS患者血清样本和漱口液样本的阳性检出率明显下降，约为30%左右，粪便样本的阳性检出率约在60%左右。
对临床确诊SARS患者连续监测的结果显示：只有在病程的某一时期，核酸的检测结果为阳性，而在发病初期和晚期，核酸的检测结果都可能为阴性。
六、使用过程中的注意事项：
1、考虑到SARS为急性传染病，为保证产品在使用过程中对使用者和环境的安全。注意事项中建议严格遵守实验室管理规范、《传染性非典型肺炎病毒研究实验室暂行管理办法》、《非典型肺炎病例实验室检测标本采集技术指南（试行）》。
2、由于样本的采集方法对采样人员有一定的危险性，注意事项中提醒采样人员应高度重视安全防护。
3、由于PCR试剂盒操作相对复杂，注意事项中建议技术人员必须经过严格的安全和技术培训。
附件：《新型冠状病毒核酸扩增（PCR）荧光检测试剂盒说明书》相关内容
【使用目的】
用于 ***** 标本中新型冠状病毒核酸RNA的定性检测，可试用于新型冠状病毒感染的辅助诊断。本品检测结果仅供临床参考，不能单独作为确诊或排除病例的依据，对实验结果的解释，详见【实验结果的解释】及【本检测方法的局限性】。
【实验结果的解释】
1. 至少符合下列情况之一才能报告该病例新型冠状病毒核酸检测结果阳性
1.1 至少2个不同类型的临床标本（例如血浆样本、粪便样本等）检测结果均为阳性；
1.2 从发病第2天起不同时间收集的相同类型的临床样本连续2次以上检测结果均为阳性；
1.3 使用2种不同的检测方法或试剂（基于其他反应原理或其他企业产品）对同一临床样本重复检测结果均为阳性。
对于检测结果阳性的报告，只表明该样本中有新型冠状病毒的遗传物质RNA存在，并不表明有活病毒存在，或病毒量足以感染其他人。
2. 现有的PCR检测方法虽然特异性较高，但灵敏度仍有欠缺，因此测定结果为阴性并不能排除样本中含有病毒。
3. 根据临床考核结果，本品的测定结果会因采样时间的不同而异，因此要将测定结果密切结合临床指征和其他测定结果进行综合分析（详见【临床考核情况】）。
【本检测方法的局限性】
1． 本品扩增引物和荧光探针是根据新型冠状病毒 pol 区加以选择、设计的，其灵敏度和特异性尚有待进一步研究、确证。
2． 本检测系统的交叉反应性还没有完全确定，特别是对冠状病毒的种属交叉反应性未进行临床考核，阳性结果不能排除扩增的是冠状病毒属的其它种病毒。
3． 目前对于各发病阶段，病毒在人体各组织部位的分布及持续时间等方面的基础研究工作有限。
4． 根据本品对临床确认SARS患者连续监测的结果：只在病程的早期，本品才有相对较高的阳性检出率，而在发病晚期，本品检测结果多数为阴性。
5． 对于PCR检测阴性的样本，不能排除样本中新型冠状病毒的存在。以下原因可导致阴性结果：
5.1 患者并未感染新型冠状病毒，而是由其他病原体（如病毒、细菌、真菌等）引起发病。
5.2 由于检测灵敏度低，造成假阴性结果。
5.3 由于病毒或病毒核酸可能只在一个较短的时间内存在（样本不同，病毒存在的时间有差别），样本并未在病毒或其核酸存在时被采集。本品对临床确诊SARE患者连续监测的结果显示：只有在病程的早期，本品才有相对较高的阳性检出率，而在发病的晚期，本品检测结果多数为阴性。
鉴于上述原因，本品仅适用于新型冠状病毒感染的辅助诊断，检测结果仅供参考，不能单独作为确诊或排除病例的依据，最终确诊应密切结合临床指征及其他实验室检测结果综合考虑。
【注意事项】
1. 各项试验要参照执行由科技部、卫生部、国家食品药品监督管理局、国家环境保护总局联合下发的《传染性非典型肺炎病毒研究实验室暂行管理办法》和《传染性非典型肺炎病毒的毒种保存、使用和感染动物模型的暂行管理办法》的有关规定。
2. 实验室规范管理：应严格按照基因扩增实验室的管理规范。实验室应按试剂配制区、样本处理区、扩增检测区分区使用。工作流程：各区物品均为专用，不得交叉使用，避免污染。操作过程应工作服、帽、鞋、手套等穿戴齐全，避免各种试剂或样品与皮肤接触。一旦发生液体的泄漏，应立即用大量的水进行冲洗，如果与皮肤伤口发生接触，应及时通知当地卫生防疫部门。
3. 人员培训：鉴于新型冠状病毒感染具有较强的传染性，PCR试剂盒操作相对复杂，试验步骤较多，为防止实验室内感染，技术人员必须经过严格的安全和技术培训。
4．采样注意事项：因新型冠状病毒有较强的传染性，能通过近距离密切接触传播，采集样本时必须做好充分的安全防护。采样容器用专用管架盛载。采完样后立即密封送检。此类标本应由专人专柜隔离保存。须标记清晰，切勿与其它病原体标本混放。所有待检样本及检验过程均应严格按《非典型肺炎病例实验室检测标本采集技术指南（试行）》执行。
5. 关于安全问题：本品试验操作应严格遵守《传染性非典型肺炎实验室生物安全操作指南》。
（1）样本的采集方法对采样人员有一定的危险性，采样人员应高度重视安全防护。（2）实验室中所有各种废弃物都应按传染物处理。实验中用过的吸头应直接打入盛有 1% 次氯酸钠的废物缸内，并与其它废弃物一同在指定的地点以指定的方式进行焚烧或毁弃。（3）试验结束后应立即清洁工作台。工作台及各种试验用品应定期用1%次氯酸钠、75%酒精或紫外灯进行消毒。
6. 试剂盒各组份使用前请充分融化并摇匀，离心管内的试剂需离心数秒后使用。
